CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2. Phương pháp tổng hợp mPEG-cholesterol, mPEG-chitosan và mPEG-
gelatin
Vật liệu mPEG-cholesterol, mPEG-chitosan được tổng hợp bằng cách sử dụng p-nitrophenyl chloroformate (NPC) để hoạt hóa mPEG và được phát triển từ
phương pháp tổng hợp mPEG-gelatin của nhóm nghiên cứu [59].
2.3.2.1. Tổng hợp vật liệu mPEG-cholesterol (mPEG-Chol)
- NPC được sử dụng để hoạt hóa mPEG và ethylenediamine (EDA) được sử
có nhóm acyl chloride (-CCOCl) được sử dụng để phản ứng với nhóm amine (- NH2) của mPEG-NH2 tạo thành vật liệu mPEG-Chol.
- Quy trình tổng hợp vật liệu mPEG-Chol được thực hiện qua 3 giai đoạn: Tổng hợp mPEG-NPC:
mPEG-NPC được tổng hợp theo cơ chế thế thân hạch trên carbonyl. Tương tự như phản ứng ester hóa, liên kết CO trong cấu trúc của NPC có tính chất khơng no và bị phân cực mạnh về phía oxy, làm xuất hiện mật độ điện tích dương trên nguyên tử carbon, tạo ra trung tâm thiếu điện tử. Trong khi đó, trên nguyên tử oxy của nhóm -OH của phân tử mPEG cịn hai đơi điện tử tự do, nên ngun tử oxy có vai trị như một tác nhân ái nhân. Trung tâm thiếu điện tử trên nguyên tử carbon của phân tử NPC gặp tác nhân ái nhân của phân tử mPEG sẽ tương tác với nhau tạo sản phẩm mPEG-NPC. Phản ứng diễn ra thuận lợi ở nhiệt độ 60 – 65ºC.
Hình 2.5. Phản ứng tổng hợp mPEG-NPC
Cân mPEG cho vào bình cầu 250 mL làm nóng chảy ở nhiệt độ 65oC trong mơi trường chân không khoảng 2 giờ để mPEG tan chảy hồn tồn. Sau đó cho NPC được vào bình cầu, khuấy ở nhiệt độ 65oC, mơi trường khí N2 trong 5 giờ. Giảm nhiệt độ xuống 40oC, cho 10 mL THF vào khuấy ở nhiệt độ phòng trong vòng 16 giờđể thu dung dịch mPEG-NPC.
Tổng hợp mPEG-NH2:
Khi có sự hiện diện của tác nhân thân hạch như nhóm amine (-NH2), phản ứng thay thế nhóm nitrophenolate sẽ xảy ra và hình thành liên kết urethane cùng sản phẩm phụ p-nitrophenol.
Hình 2.6. Phản ứng tổng hợp mPEG-NH2
Dung dịch mPEG-NPC được nhỏ từ từ vào dung dịch EDA. Phản ứng diễn ra trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp thu được đem kết tủa trong 500 mL diethyl ether và lọc hút chân khơng. Hịa tan tủa trong nước và thẩm thẩm tách bằng màng 3,5 kDa trong 72 giờ. Tiến hành đông khô thu sản phẩm thu mPEG-NH2 ở dạng bột, màu trắng mịn.
Tổng hợp mPEG-Chol:
Cholesteryl chloroformate (CCF) có nhóm acyl chloride (-COCl) được sử dụng để phản ứng với nhóm amine (-NH2) của mPEG-NH2 tạo thành vật liệu mPEG-Chol.
Hình 2.7. Phản ứng tổng hợp mPEG-Chol
Cân mPEG-NH2 và CCF cho vào cốc 100 mL. Sau đó, 50 mL chloroform được cho vào và phản ứng diễn ra ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
2.3.2.2. Tổng hợp vật liệu mPEG-chitosan (mPEG-CS)
- NPC được sử dụng để hoạt hóa mPEG trước khi tiến hành phản ứng với dung dịch chitosan tạo thành vật liệu mPEG-CS.
- Quy trình tổng hợp vật liệu mPEG-Chol được thực hiện qua 3 giai đoạn: Tổng hợp mPEG-NPC:
Tương tự giai đoạn 1 của quy trình tổng hợp vật liệu mPEG-Chol (Mục 2.3.2.1)
Tạo dung dịch chitosan:
Chitosan (100000-300000 Da) được hòa tan vào nước cất, khuấy ở tốc độ 300 vòng/phút. Tiến hành nhỏ từng giọt dung dịch HCl 1M vào dung dịch chitosan sao cho pH dung dịch bằng 5. Khuấy ở tốc độ 300 vịng/phút cho đến khi chitosan tan hồn tồn để thu được dung dịch chitosan.
Tổng hợp mPEG-CS:
Nhỏ từng giọt dung dịch mPEG đã hoạt hóa vào dung dịch chitosan, khuấy 300 vòng/phút trong 24 giờ. Dung dịch mPEG-CS được thẩm tách bằng màng (MWCO: 12-14 kDa) trong 4 ngày bằng nước cất. Tiến hành đông cô dung dịch mPEG-CS thu sản phẩm.
2.3.2.3. Tổng hợp vật liệu mPEG-gelatin (mPEG-Gel)
- NPC được sử dụng để hoạt hóa mPEG trước khi tiến hành phản ứng với dung dịch gelatin tạo thành vật liệu mPEG-Gel.
- Quy trình tổng hợp các vật liệu mPEG-Gel được thực hiện qua 3 giai đoạn: Tổng hợp mPEG-NPC:
Tương tự giai đoạn 1 của quy trình tổng hợp vật liệu mPEG-Chol (Mục 2.3.2.1)
Tạo dung dịch gelatin:
Gelatin loại A (~300 g Bloom) được hòa tan vào nước cất, khuấy ở tốc độ 300 vòng/phút để thu được dung dịch gelatin.
Tổng hợp mPEG-Gel:
Nhỏ từng giọt dung dịch mPEG đã hoạt hóa vào dung dịch gelatin, khuấy 300 vòng/phút trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng. Dung dịch mPEG-Gel được thẩm tách bằng màng (MWCO: 12 – 14 kDa) trong 3 ngày bằng nước cất. Tiến hành đông khô thu sản phẩm.
2.3.2.4. Phương pháp đánh giá
Cấu trúc sản phẩm thu được xác định bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- NMR và phổ hồng ngoại biến đổi FT-IR.