2. ENZYM α-GLUCOSIDASE
3.6.2. Chống lại tác nhân gây đột biến
Ames cùng các cộng sự đã xác định khả năng chống lại tác nhân gây biến Trp-P-1 (3-amino-1,4-dimetyl-5H-pyrido[4,3-b]indol) trong thức ăn của dịch trích MeOH từ quả núc nác. Tác nhân ức chế chính được xác định là baicalein với giá trị IC50 là 2,78 ± 0,15 μM. [28]
3.6.3. Chống ung thƣ
Nghiên cứu 11 cây thuốc được dùng trị bệnh trong dân gian ở Bangladesh, kết quả cho thấy dịch núc nác cho hoạt tính độc tế bào mạnh nhất với tất cả tế bào khối u. Giá trị IC50 là 19,6 mg mL-1 với CEM, 14,2 mg mL-1 với HL-60, 17,2 mg mL-1 với B-16 và với HCT-8 là 32,5 mg mL-1. [21]
3.6.4. Ức chế tăng sinh tế bào
Dịch EtOH của vỏ thân núc nác cho hoạt tính ức chế tăng sinh với một số tế bào như erythleukemic K 562 (IC50 = 30,77 ± 0,32 mg mL-1), lympho B Raji (IC50 = 23,20 ± 9,6 mg mL-1), lympho T Jurkat (IC50 = 4,11 ± 0,10 mg mL-1). [18]
Như chúng ta đã biết, bệnh đái tháo đường là một căn bệnh mãn tính nguy hiểm và đang tăng dần trên toàn thế giới. Trong đó, số người bị đái tháo đường loại 2 chiếm đến 90% các trường hợp mắc bệnh. Một phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường loại 2 được quan tâm hiện nay là làm giảm sự tạo thành glucose thông qua việc ức chế enzym -glucosidase. Mặc dù hiện nay trên thị trường đã xuất hiện nhiều loại thuốc trị đái tháo đường loại 2 theo hướng này nhưng chúng vẫn còn nhiều tác dụng phụ. Do đó, việc tìm kiếm hợp chất mới có khả năng ức chế enzym
-glucosidase từ thiên nhiên luôn được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới.
Theo tham khảo tài liệu, có nhiều loại hợp chất có hoạt tính ức chế enzym α-
glucosidase, điều này cho thấy tiềm năng to lớn trong việc cô lập các hoạt chất này từ tự nhiên. Trong phạm vi đề tài, chúng tôi tập trung nghiên cứu hoạt tính ức chế
enzym α-glucosidase của một số cây thuốc ở vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên, tỉnh
An Giang là nơi có nhiều cây thuốc quý vẫn chưa được nghiên cứu. Từ kết quả sàng lọc các mẫu cây thuốc ban đầu, chúng tôi sẽ chọn ra cây thuốc có hoạt tính mạnh để tiến hành cô lập, xác định cấu trúc và nghiên cứu hoạt tính các hợp chất.
- 43 -
THỰC NGHIỆM
1. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 1.1. Hóa chất
Acetonitril (SCharlau)
Cloroform (công nghiệp, Chemsol 99%)
Dimethyl sulfoxid (DMSO) (Trung Quốc 98%) Etyl acetat (công nghiệp, Chemsol 99,5%) Hexan (Chemsol)
Metanol (công nghiệp, Chemsol 99,7
α-Glucosidase from Saccharomyces cerevisae (Sigma G 0660-750UN)
p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranodase (pNPG) (Sigma N1377-1G)
Acid tannic (Merck)
NaH2PO4.2H2O (Trung Quốc 99%)
Na2HPO4.12H2O (Trung Quốc 99%)
Na2CO3 (Trung Quốc 99,8%)
Sắc ký cột: silica gel pha thường (HIMEDIA 230-400 mesh), pha đảo (Merck).
Sắc ký bản mỏng: pha thường (Kielselgel 60 F245), pha đảo (60 RP-18 F254S).
1.2. Thiết bị
Bồn điều nhiệt. Cân kỹ thuật. Cân phân tích.
Đèn UV-VIS (Spectroline MODEL ENF-240C/FE, USA). Hệ thống đông cô chân không.
Hệ thống cô quay chân không.
Máy quang phổ (SHIMADZU UV-1800).
Máy ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Bruker Ultrashield 500 Plus).
1.3. Dụng cụ
Becher 1000 mL, 500 mL, 100 mL, 50 mL. Bình cầu 2000 mL, 1000 mL, 500 mL.
- 45 - Bình quả lê 1000 mL, 500 mL, 250 mL, 100 mL. Erlen 1000 mL, 500 mL, 250 mL, 100 mL. Fiol 1000 mL, 100 mL, 25mL, 20 mL, 5 mL. Phễu chiết 2000 mL, 1000 mL. Ống COD. Pipet 10 mL; 2mL; 0,1 mL. Micropipet. Vial nhựa 1,5 mL; 2 mL. Cuvet thủy tinh.
Cột sắc ký điều chế.
Và các dụng cụ thông thường khác như đũa thủy tinh, giấy lọc, …
2. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE2.1. Điều chế cao thô 2.1. Điều chế cao thô
2.1.1. Nguyên liệu
Với mục đích sàng lọc, tìm ra những cây thuốc có hoạt tính ức chế enzym α-
glucosidase từ nguồn cây thuốc dồi dào của Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thu thập ngẫu nhiên mẫu cây thuốc từ các vùng miền trong cả nước và khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của chúng. Trong phạm vi đề tài, chúng tôi tập trung nghiên cứu 40 cây thuốc ở vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang (Bảng 2.1). Các cây được lựa chọn trong đề tài theo tiêu chí là các cây có công dụng trị bệnh đái tháo đường, ung thư, kháng viêm trong dân gian, theo tài liệu tham khảo hoặc lựa chọn ngẫu nhiên.
Những cây thuốc này được thu hái vào tháng 8 năm 2009 và được định danh bởi Thạc sĩ Hoàng Việt, khoa Sinh Học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên.
Bảng 2.1: Danh mục các cây thuốc nghiên cứu trong đề tài
Số Tên thƣờng Tên khác Tên khoa học Họ Bộ phận dùng Công dụng
1 Bồ ngót Bù ngót, hắc diện
thần
Sauropus androgynus (L.) Merr.
Thầu dầu
(Euphorbiaceae) Toàn cây
Ban sởi, ho, viêm phổi, sốt, lậu
2 Cam thảo đất Giả cam thảo Scoparia dulcis L. Hoa mõm sói
(Scrophulariaceae) Toàn cây
Ho, phù thủng, sốt, tim mạch, huyết áp 3 Cỏ cứt lợn Cỏ hôi, cây bù xích Ageratum conyzoides L. Cúc (Asteraceae) Phần trên mặt đất Chống viêm, mụn nhọt, ngứa lở, eczema
4 Cỏ may Chrysopogon aciculatus
(Retz.) Trin.
Lúa
(Poaceae) Toàn cây
Tiêu độc, lợi tiểu, da vàng, trị giun.
5 Cỏ mần trầu Cỏ dáng, cỏ bắc Eleusine indica (L.) Gaertn. Lúa
(Poaceae) Toàn cây
Cao huyết áp, lao phổi, viêm , sốt rét
6 Cỏ tranh Bạch mao Imperata cylindrica
(L.) P.Beauv.
Lúa
(Poaceae) Rễ Sốt vàng da, đái buốt,
ho thổ huyết
7 Cườm gạo Ý dĩ, bo bo, dĩ
nhân Coix lachrymal - jobi L.
Lúa
(Poaceae) Hạt Sỏi, tê phù, vàng da,
bạch đới
8 Cứt quạ Hoa bát, cầu qua
trái đắng
Gymnopetalum cochinchinense (Lour.)
Kurz
Bầu bí
(Cucurbitaceae) Toàn cây
Viêm, sốt, eczema, bỏng, lao bạch cầu
9 Dền voi Vòi voi, cẩu vĩ
trùng Heliotropium indicum L.
Vòi voi
(Boraginaceae) Toàn cây
Phong thấp sưng khớp, viêm, lị, viêm
10 Dứa gai Dứa dại, dứa gỗ Pandanus tectorius
Parkinson ex Zucc.
Dứa dại
(Pandanaceae) Quả Xơ cứng động mạch,
- 47 -
Bảng 2.1: Danh mục các cây thuốc nghiên cứu trong đề tài [3] [4]
Số Tên thƣờng Tên khác Tên khoa học Họ Bộ phận
dùng Công dụng
11 Điên điển Điền thanh hạt
tròn
Sesbania paludosa (Roxb.) Prain
Đậu
(Fabaceae) Toàn cây
Mụn nhọt, thuốc điều kinh, săn da
12 Đinh lăng Cây gỏi cá Polyscias fruticosa (L.)
Harms
Nhân sâm
(Araliaceae) Lá
Ho ra máu, chữa kiết lị, phong thấp.
13 Hoàng đằng Nam hoàng liên Fibraurea tinctoria Lour.
Tiết dê (Menispermaceae
)
Thân Sưng, viêm, sốt rét, lị
14 Huyết rồng Dây kim luông,
mo thùy hoa nhỏ
Spatholobus parviflorus
(Roxb. ex DC.) Kuntze
Đậu
(Fabaceae) Dây Bổ máu
15 Khúc khắc Thổ phục linh
nam
Heterosmilax polyandra
Gagnep
Khúc khắc
(Smilacaceae) Củ Phong thấp, viêm khớp,
viêm thận
16 Kiến cò bạch hạc, cây lác Rhinacanthus nasutus (L.)
Kurz
Ô rô
(Acanthaceae) Toàn cây
Lao phổi, ho, viêm, huyết áp cao
17 Lá lốt Tất bát Piper lolot C.DC. Hồ tiêu
(Piperaceae) Lá
Phong hàn, tê bại, rối loạn tiêu hóa
18 Lọ nồi Hydnocarpus ilicifolia King Chùm bao
(Kiggelariaceae) Thân Phong cùi, ghẻ, huyết hư
19 Mã đề Xa tiền, nhã én Plantago major L. Mã đề
(Plantaginaceae)
Phần trên mặt
đất Sỏi niệu, viêm, ho
20 Ngải cứu Thuốc cứu, ngải
điệp Artemisia vulgaris L.
Cúc
(Asteraceae) Lá
Đau dạ dày, đau khớp, ngứa, ezema
Bảng 2.1: Danh mục các cây thuốc nghiên cứu trong đề tài
Số Tên thƣờng Tên khác Tên khoa học Họ Bộ phận
dùng Công dụng
21 Ngô Bắp Zea mays L. Lúa
(Poaceae) Râu
Viêm thận, gan, sỏi mật, huyết áp cao.
22 Nhãn lồng Lạc tiên, long
châu Passiflora foetida L.
Lạc tiên
(Passifloraceae) Thân
Suy nhược thần kinh, ho, phù thủng
23 Nhàu nhà Mặt quỷ Morinda citrifolia L. Cà phê
(Rubiaceae) Toàn cây Sốt, cao huyết áp
24 Núc nác Nam hoàng bá Oroxylum indicum (L.) Kurz Núc nác
(Bignoniaceae)
Thân Vàng da, ngứa, viêm,
sởi, vẩy nến
25 Ô rô Ắc ó Acanthus integrifolius T.
Anderson
Cúc
(Asteraceae) Toàn cây
Thổ huyết, băng đới, tiêu thủng
26 Quao Dolichandrone spathacea
(L.f.) K.Schum
Núc nác
(Bignoniaceae) Toàn cây Gan, hen suyễn, tiêu độc
27 Ráng bay Cây chồn đèn Drynaria quercifolia (L.) J.
Smith
Dương xỉ
(Polypodieceae) Củ Phong thấp, sai khớp,
thận suy
28 Ráy gai Mớp gai, củ chóc
gai Lasia spinosa (L.) Thwaites
Ráy
(Araceae) Rễ Viêm thận, gan, ho,
viêm họng
29 Râu mèo Cây bông bạc Orthosiphon spiralis (Lour.)
Merr.
Hoa môi
(Lamiaceae) Toàn cây
Viêm thận, viêm bàn quan, thấp khớp
30 Sài hồ Lức, lức cây, sài
hồ nam Pluchea pteropoda Hemsl.
Cúc
- 49 -
Bảng 2.1: Danh mục các cây thuốc nghiên cứu trong đề tài [3] [4]
Số Tên thƣờng Tên khác Tên khoa học Họ Bộ phận dùng Công dụng
31 Thăng ma Thăng ma núi Goniothalamus
gabriacianus (Baill.) Ast
Na
(Annonaceae) Rễ Giải độc, trừ ban trái
32 Thần thông Dây thần thông, rễ
gió
Tinospora cordifolia
(Willd.) Miers.
Tiết dê
(Menispermaceae) Thân Sốt rét, viêm
33 Thiên tuế Thiết thụ Cycas pectinata Griff. Tuế
(Cycadaceae) Hạt Ho lao, tê đau, tán
huyết chỉ thống
34 Thù lù bao Lồng đèn, tầm bóp Solanum nigrum L. Cà
(Solanaceae) Toàn cây
Cảm sốt, ho, viêm gan, viêm phế quản
35 Thường sơn Nam thường sơn Dichroa febrifuga Lour. Ô rô
(Acanthaceae) Lá Sốt rét
36 Tơ hồng xanh Tơ xanh Cassytha filiformis L. Long não
(Lauraceae) Toàn cây
Sốt, viêm thận, phù thủng, sỏi, viêm gan
37 Trắc bá Trắc bách Platycladus orientalis (L.)
Franco
Trắc bách
(Cupressaceae) Lá
Thuốc cầm máu, lợi tiểu, ho sốt, ho ra máu
38 Trần bì Quít, hoàng quyết Citrus deliciosa Tenore Cam
(Rutaceae) Vỏ Ăn uống không tiêu
39 Vông nem Hải đồng bì, thích
đồng bì
Erythrina orientalis (L.) Merr
Đậu
(Fabaceae) Toàn cây
Hạ huyết áp, sát trùng, trừ phong thấp, kiết lị.
40 Xuyên tâm
liên Khổ đảm thảo Andrographis paniculata
(Burm.f.) Wall. Ex Nees
Ô rô
(Acanthaceae) Toàn cây
Cảm sốt, viêm phổi, huyết áp cao
2.1.2. Ly trích
Mẫu dược liệu được phơi khô, xay nhỏ và trích nóng với MeOH theo phương pháp đun hoàn lưu. Mỗi mẫu cây được trích 3 lần, mỗi lần 3 giờ. Dịch trích đem cô quay chân không, thu được cao MeOH thô dùng làm mẫu để thử hoạt tính.
MẪU CÂY THUỐC KHÔ
- Xay nhỏ
- Trích nóng bằng MeOH - Lọc
DỊCH TRÍCH
Cô quay chân
không
CAO MeOH
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ điều chế cao thô
2.2.Thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase
2.2.1. Nguyên tắc
Để khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase, ta sử dụng p-nitrophenyl
α-D-glucopyranosid (pNPG) làm chất nền. Chất nền sẽ bị enzym α-glucosidase chuyển hóa thành α-D-glucose và p-nitrophenol (pNP).
51 O H O H O H O O H O O 2 N O H α-glucosidase O H O H O O H O H O H N O 2 p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (pNPG) α-D-Glucose p-Nitrophenol
Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỉ lệ với lượng p-nitrophenol. Khi mẫu
có sự ức chế enzym α-glucosidase thì hàm lượng p-nitrophenol cũng như lượng
glucose tạo thành sẽ giảm. Lượng p-nitrophenol sinh ra được xác định bằng cách đo
độ hấp thu quang tại bước sóng 401nm. Vì vậy, dựa trên độ hấp thu của p-
nitrophenol sinh ra ở 401 nm khi có và không có mẫu thử sẽ tính được khả năng ức
chế enzym α-glucosidase của mẫu khảo sát.
Chuẩn bị hóa chất
Đệm pH = 7,0 (0.01 M): hút 14 mL dung dịch Na2HPO4 0.2 M và 15 mL
dung dịch NaH2PO4 0.5 M cho vào becher 1000 mL. Thêm nước cất 1 lần và chỉnh
đệm đến pH = 7,0, sau đó định mức bằng fiol 1000 mL đến vạch định mức.
Dung dịch Na2CO3 0,1M: cân 10,62 gam muối Na2CO3 khan, hòa tan trong
1000 mL nước cất.
Enzym α-glucosidase 0,2 U mL-1: cân 0,09 mg enzym, hòa tan trong fiol 20 mL bằng đệm photphat pH = 7,0 và giữ mát để đảm bảo tính ổn định của kết quả.
Dung dịch nền pNPG 3 mM: cân và hòa tan 22,82 mg pNPG bằng đệm phosphat pH = 7,0 trong fiol 25 mL, nền được giữ trong tối để tránh bị phân hủy dưới ánh sáng mặt trời.
Mẫu khảo sát được chuẩn bị ở nồng độ 1000 g mL-1 (đối với mẫu cao) và
2.2.2. Qui trình thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase (Sơ đồ 2.2) V1 µL đệm pH 7.0 V2 µL dung dịch mẫu 100 µL enzym 0.2 U mL-1 Lắc đều, ủ ở 370C trong 5 phút 100 µL dung dịch nền 3 mM Lắc đều, ủ ở 370C trong 30 phút 1500 µL dung dịch Na2CO3 0.1M Đo quang ở 401 nm
Sơ đồ 2.2: Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase
Mỗi mẫu được thử ở 4 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ thực hiện 3 lần. Với
mỗi nồng độ mẫu thử có kèm theo một mẫu trắng, trong đó thể tích enzym được thay bằng thể tích đệm tương ứng.
53
Bảng 2.2: Thể tích các hóa chất trong quy trình thử hoạt tính
Thể tích (μL) Control C (μg mL -1 ) 100 50 25 10 Mẫu trắng Mẫu thử Mẫu trắng Mẫu thử Mẫu trắng Mẫu thử Mẫu trắng Mẫu thử Mẫu trắng Mẫu thử Đệm 4800 2300 4000 1900 4400 2100 4600 2200 4720 2260 Mẫu - - 800 400 400 200 200 100 80 40 Enzym - 100 - 100 - 100 - 100 - 100 Nền 200 100 200 100 200 100 200 100 200 100 Na2CO3 3000 1500 3000 1500 3000 1500 3000 1500 3000 1500
Trong quy trình thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase này, chúng tôi sử
dụng acarbose (Hình 2.1) và acid tannic (Hình 2.2) làm chất đối chứng dương.
Hình 2.2: Cấu trúc của acid tannic (C76H52O46)
2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá khả năng ức chế enzym α-glucosidase
Khả năng ức chế enzym α-glucosidase được tính dựa trên phần trăm ức chế
(I%) theo công thức:
Với :
I(%) = Ac - As
Ac *100%
Ac: giá trị mật độ quang của dung dịch không chứa mẫu khảo sát. As: giá trị mật độ quang của dung dịch chứa mẫu khảo sát.
Giá trị I% ứng với từng nồng độ khảo sát sẽ là trung bình cộng của 3 giá trị mật độ quang đo được ở mỗi nồng độ.
Với những mẫu có hoạt tính biến thiên theo nồng độ, vẽ đường thẳng y = ax + b qua tất cả các điểm (với y là giá trị phần trăm ức chế và x là nồng độ khảo sát tương ứng).
Với những mẫu có hoạt tính không biến thiên tuyến tính với nồng độ, một cách gần đúng, chọn 2 nồng độ có giá trị phần trăm ức chế trên và dưới 50%, và cũng vẽ đường thẳng y = ax + b.
55
Từ phương trình y = ax + b với 2 hệ số a, b đã biết, thế y = 50% vào sẽ tính được giá trị x là nồng độ của mẫu khảo sát mà tại đó có thể ức chế được 50% enzym, kí hiệu là IC50. Giá trị IC50 giúp đánh giá khả năng ức chế của mẫu khảo sát là mạnh hay yếu, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp.
2.3. Khảo sát động học xác định kiểu ức chế và hằng số ức chế Ki
Trong khảo sát động học enzym, phương trình Lineweaver-Burk có dạng đường thẳng y = ax + b có ý nghĩa rất lớn trong việc nghiên cứu cơ chế chất ức chế.
1 K
v o V *
1 1
[ S ] V
Từ đường biểu diễn 1/vo theo 1/[S] ta xác định được K là hằng số ức chế, ứng với mỗi kiểu ức chế có hằng số K khác nhau.
Hình 2.3: Đường biểu diễn phương trình Lineweaver-Burk
Như vậy, để nghiên cứu động học của enzym trên chất ức chế khảo sát theo phương trình Lineweaver-Burk thì ta cần phải biết giá trị IC50, thời gian phản ứng xúc tác enzym xảy ra nhanh nhất và khoảng tuyến tính nồng độ chất nền.
2.3.1. Khảo sát thời gian phản ứng
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng trên mẫu control (mẫu
không có ức chế). Khi khảo sát thời gian phản ứng thì không sử dụng Na2CO3 để
dừng phản ứng mà đem đo quang ngay sau khi cho nền.
3800 µL đệm pH 7.0
Sơ đồ 2.3: Quy trình khảo sát thời gian phản ứng
Đo liên tục trong vòng 60 phút, sau đó vẽ đồ thị biểu diễn mật độ quang theo thời gian, từ khoảng tuyến tính trên đồ thị sẽ xác định được thời gian phản ứng nhanh nhất.
2.3.2. Khảo sát nồng độ chất nền
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất nền trên mẫu control (mẫu không có ức chế) bằng cách thay đổi nồng độ của chất nền. Sau khi thêm chất nền và ủ trong thời gian t phút (vừa được xác định ở trên) rồi tiến hành đo mật độ quang, khoảng nồng độ chất nền tối ưu được chọn phải tuyến tính theo mật độ quang A. Bảng 2.3: Thể tích các dung dịch khảo sát nồng độ chất nền Đệm (μL) 3600 3500 3400 3300 3200 Enzym (μL) 100 Nền (μL) 300 400 500 600 700 2.3.3. Xác định kiểu ức chế
57
Để xác định kiểu ức chế của chất ức chế tác dụng lên enzym, sau khi tiến hành thử hoạt tính để xác định giá trị IC50, tiến hành khảo sát từ 3 đến 5 nồng độ