2. ENZYM α-GLUCOSIDASE
2.3. Động học phản ứng xúc tác của enzym
Phản ứng do enzym xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nồng độ enzym, bản chất và nồng độ các chất phản ứng (chất nền), nhiệt độ, pH của môi trường, các ion kim loại, các chất vô cơ và hữu cơ khác, ... Điều đáng lưu ý là các yếu tố hóa lý không chỉ ảnh hưởng đến phản ứng enzym theo kiểu giống như các phản ứng hóa học thông thường mà còn ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng thông qua tác dụng của chúng đối với cấu trúc phân tử enzym.
2.3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ enzym
Trong điều kiện dư thừa chất nền, nghĩa là [S] >> [E] thì tốc độ phản ứng phụ thuộc vào [E], v = K[E] có dạng y = ax. Nhờ đó người ta đã đo [E] bằng cách đo vận tốc phản ứng do enzym đó xúc tác.
Có nhiều trường hợp trong môi trường có chứa chất ức chế hay hoạt hóa thì vận tốc phản ứng do enzym xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] đó.
- 9 -
Hình 1.2: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E]
2.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ chất nền [S]
Ta khảo sát trường hợp đơn giản nhất: chỉ một chất nền S, E xúc tác tạo thành một sản phẩm P
Sơ đồ 1.1: Sơ đồ phản ứng xúc tác enzym trường hợp có 1 chất nền
Phức ES gọi là phức Michaelis- Menten.
Gọi v1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES.
Gọi v-1 là vận tốc của phản ứng phân ly phức chất ES tạo thành E và S. Gọi v2 là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P (sản phẩm).
v1 = k1[E][S] v-1 = k-1[ES] v2 = k2[ES] Khi hệ thống đạt trạng thái cân bằng ta có:
k-1[ES] + k2[ES] = k1[E][S] (1)
m
o
Gọi Eo là nồng độ enzym ban đầu, [E] là nồng độ enzym tự do:
[Eo] = [E] + [ES] => [E] = [Eo] - [ES] (3) Thay trị số [E] từ (3) vào (2) ta có:
(k-1 + k2)[ES] = k1([Eo] - [ES])[S] Nếu đặt Km= k 1Ệ k 2
(K : gọi là hằng số Michalis Menten) thì:
k1
[ES ] [ Eo ][S ]
K m [S ]
Mặt khác vận tốc phản ứng tạo thành sản phẩm P: Vo = k2[ES]
(với Vo là vận tốc đầu của phản ứng mà lúc nồng độ sản phẩm chưa đáng kể
và sự tạo thành ES từ sản phẩm (E+P) có thể bỏ qua). Thay [ES] bằng giá trị ở trên ta thu được:
V k 2 [ Eo ][ S ]
K m [S ] (4)
Qua đây ta thấy nồng độ enzym càng cao thì vận tốc phản ứng enzym càng lớn. Vận tốc đạt cực đại khi toàn bộ enzym liên kết với chất nền, nghĩa là:
Vmax= k2[Eo] (5)
(với Vmax là vận tốc phản ứng cực đại khi toàn bộ khi toàn bộ E kết hợp với S tạo thành phức ES).
Thay (5) vào phương trình (4) ta được:
Vo Vmax
K
[S ]
m [S ] (*)
Phương trình (*) gọi là phương trình Michaelis Menten.
Km là hằng số Michaelis đặc trưng cho mỗi enzym, đặc trưng cho cho ái lực
của enzym với chất nền, Km càng nhỏ thì ái lực của chất nền với enzym càng lớn,
tốc độ phản ứng càng cao vì vận tốc cực đại Vmax đạt ở giá trị nồng độ chất nền càng thấp.
Ý nghĩa thực tiễn của hằng số Michaelis là ở chỗ nó chính là giá trị của nồng độ chất nền khi tốc độ phản ứng bằng ½ tốc độ tối đa. Thay Vmax và Vo bằng các
- 11 -
con số tương ứng 1 và 0,5 vào phương trình trên, ta sẽ thấy rõ điều đó.
Như vậy, Km được đo bằng đơn vị nồng độ, tức mol/l.
Trên cơ sở phương trình Michaelis-Menten, bằng cách xây dựng đường biểu diễn sự phụ thuộc của vo vào [S] và bằng đồ thị đó xác định tốc độ tối đa Vmax ta có thể tìm thấy giá trị của [S], ở đó Vo = Vmax/2, tức giá trị của Km (Hình 1.3).
Hình 1.3: Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ chất nền.
Khi tăng [S] thì vận tốc phản ứng v tăng, tăng [S] đến một giá trị nào đó thì v đạt đến giá trị Vmax và sẽ không tăng nữa nếu ta vẫn tiếp tục tăng [S]. Khi Km = [S] thì Vo = 1/2 Vmax
Năm 1934, Lineweaver và Burk, trên cơ sở của phương trình (5) đã nghịch đảo để biến thành dạng đường thẳng y = ax+b, nó có ý nghĩa lớn đối với việc nghiên cứu ức hãm enzym. Phương trình (*) sẽ trở thành:
1 K m Vo Vmax 1 [S ] 1 Vmax (**)
Phương trình này gọi là phương trình Lineweaver - Burk
2.3.3. Ảnh hƣởng của chất ức chế
Chất ức chế là chất có tác dụng làm giảm hoạt độ hay làm enzym không còn khả năng xúc tác biến chất nền thành sản phẩm.
2.3.3.1. Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition)
Trong trường hợp ức chế cạnh tranh, chất nền và chất ức chế cạnh tranh nhau để tác dụng lên trung tâm hoạt động của enzym.
Hình 1.5: Kiểu ức chế cạnh tranh
Phương trình Michealis-Menton cho kiểu ức chế cạnh tranh:
Vo Vmax [S ]
K m K ct [S ] (6)
=> Phương trình Lineweaverr- Burk khi có chất ức chế cạnh tranh:
1 K ct Vo Vmax 1 [S ] 1 Vmax (7)
Với Kct là hằng số cân bằng của kiểu ức chế cạnh tranh.
Dựa vào phương trình (7) ta thấy: nếu nồng độ chất nền dư thừa, nồng độ chất ức chế thấp thì có thể loại bỏ tác dụng của chất ức chế, còn nồng độ chất nền thấp và nồng độ chất ức chế cao thì lại có tác dụng ức chế hoàn toàn.
Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaverr- Burk khi có chất ức chế cạnh tranh.
- 13 -
Hình 1.6: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver-Burk khi có ức chế cạnh tranh
Kiểu ức chế này cho thấy đường thẳng có nồng độ chất ức chế càng cao thì
có độ xiên lớn hơn và các đường thẳng cùng cắt trục tung ở một điểm là 1/Vmax
Người ta thấy ức chế như vậy phần lớn giữa chất ức chế và chất nền có sự tương đồng về mặt hóa học. Ví dụ: acid malic có cấu trúc gần giống với acid succinic nên ức chế cạnh tranh enzym succinatdehydrogenase, là enzym xúc tác cho sự biến đổi acid succinic thành acid fumaric.
Trường hợp đặc biệt của ức chế cạnh tranh là ức chế bằng sản phẩm. Trường hợp này xảy ra khi một sản phẩm phản ứng tác dụng trở lại enzym và choán vị trí hoạt động ở phân tử enzym.
Xác định Ki của kiểu ức chế cạnh tranh
Đối với kiểu ức chế cạnh tranh, ta có: K ct K m[1 [I ]] hay:
K
K ct K m
K i
i
[ I ] K m
Lập đồ thị Kct theo [I], vẽ đường thẳng biểu diễn Kct theo [I] sẽ cắt trục hoành tại - Ki (khi Kct = 0) (Hình 1.7).
Hình 1.7: Đồ thị biểu diễn Kct theo [I] khi có chất ức chế cạnh tranh để xác định Ki.
2.3.3.2. Ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition)
Đặc trưng của kiểu ức chế này là chất ức chế chỉ liên kết với phức hợp ES, mà không liên kết với enzym tự do.
Hình 1.8: Kiểu ức chế kháng cạnh tranh.
Phương trình Michealis-Menton cho kiểu ức chế kháng cạnh tranh:
Vo Vkct [ S ] (8)
K kct [ S ]
Phương trình Lineweaver-Burk khi có chất ức chế kháng cạnh tranh:
1 K kct Vo Vkct 1 [S ] 1 Vkct (9) Với Kkct là hằng số ức chế theo kiểu kháng cạnh tranh.
- 15 -
Trong trường hợp này ta thấy khi E kết hợp với S làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzym và tạo trung tâm kết hợp với I, do đó không thể loại bỏ tác dụng ức chế bằng cách tăng nồng độ chất nền.
Hình 1.9: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver-Burk khi có ức chế kháng cạnh tranh
Kiểu ức chế này cho thấy các đường thẳng có độ nghiêng bằng nhau, song song với nhau không hội tụ tại một điểm.
Xác định Ki kiểu ức chế kháng cạnh tranh Ta có Vkct V ; 1 [I ] K i K kct K m 1 [I ] K i Do đó 1 Vkct 1 Vmax [I ] K i 1 Vmax và 1 K kct 1 [I ] 1 K m Ki K m
Để xác định Ki, lập đồ thị 1/Vkct hoặc 1/Kkct theo [I], đường biểu diễn sẽ cắt trục hoành ở điểm –Ki (Hình 1.10)
a) b)
Hình 1.10: Đồ thị biểu diễn 1/Vkct (a) và 1/Kkct (b) theo [I] khi có chất ức chế kháng cạnh tranh để xác định Ki
2.3.3.3. Ức chế không cạnh tranh (noncompetitive inhibitor)
Ức chế không cạnh tranh là kiểu ức chế mà enzym có thể kết hợp với hoặc chất ức chế, hoặc chất nền, hoặc cả hai.
Hình 1.11: Kiểu ức chế không cạnh tranh
Phương trình Michealis-Menton cho kiểu ức chế không cạnh tranh:
Vo Vkoct [ S ]
(10)
- 17 -
Phương trình Lineweaver-Burk khi có chất ức chế không cạnh tranh:
1 K m Vo Vkoct 1 [S ] 1 Vkoct (11)
Với Kkoct là hằng số ức chế của kiểu ức chế không cạnh tranh.
Hình 1.12: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver-Burk khi có ức chế không cạnh tranh
Kiểu ức chế này cho thấy các đường thẳng càng có nồng độ chất ức chế càng
cao thì có độ xiên lớn hơn và các đường thẳng cùng hội tụ tại một điểm 1/Km nằm
trên trục hoành.
Xác định Ki kiểu ức chế không cạnh tranh
Vmax Ta có Vkoct 1 [I ] K i Do đó 1 Vkoct 1 Vmax [I ] K i 1 Vmax
Để xác định Ki, lập đồ thị 1/Vkoct theo [I], đường thẳng biểu diễn sẽ cắt trục
Hình 1.13: Đồ thị biểu diễn 1/Vkoct theo [I] khi có chất ức chế không cạnh tranh để xác định Ki
2.3.3.4. Ức chế hỗn tạp (mixed inhibition)
Ức chế hỗn tạp là kiểu ức chế mà chất ức chế không những liên kết với enzym tự do mà còn liên kết với cả phức hợp ES tạo thành phức hợp EIS không tạo được sản phẩm P. Hiện tượng ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất ức chế. Tốc độ cực đại đo được khi không có mặt chất ức chế là cao hơn khi có mặt chất ức chế.
Giá trị Km thay đổi không giống như trong trường hợp ức chế cạnh tranh.
Phương trình Michealis-Menton cho kiểu ức chế hỗn tạp:
V o V ht [ S ]
(12)
1 [ I ]
K si [ S ]
Với Kht K i (K là hằng số cân bằng tạo thành ESI)
Vht 1 V si [I ] si 1 [I ] si
Phương trình Lineweaver-Burk cho kiểu ức chế hỗn tạp:
1 K ht Vo Vht 1 [S ] 1 Vht (13)
- 19 -
K K [I ]
Tương quan giữa Kht và Vht là: ht
Vht
m
1 Vmax i
Lập đồ thị 1/V0 theo 1/[S] của phương trình (13), đường biểu diễn khi có chất ức chế sẽ cắt đường biểu diễn khi không có I không nằm trên trục tung cũng không nằm trên trục hoành. (Hình 1.14)
Hình 1.14: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver-Burk khi có ức chế hỗn tạp
Kiểu ức chế này cho thấy các đường thẳng càng có nồng độ chất ức chế càng cao thì có độ xiên lớn hơn và các đường thẳng cùng hội tụ tại một điểm không nằm trên trục tung.
Xác định Ki của kiểu ức chế hỗn tạp
Ta có: K ht K m
1 [I ] hay K ht K m
[ I ] K m
Vht Vmax K i Vht Vmax .K i Vmax
Để xác định Ki, lập đồ thị Kht/Vht theo [I], đường biểu diễn sẽ cắt trục hoành ở điểm –Ki (Hình 1.15)
Bảng 1.1: Tóm tắt ảnh hưởng của kiểu ức chế lên Vmax và Km.
Kiểu ức chế Cạnh tranh Kháng cạnh tranh Hỗn tạp Không cạnh tranh
Vmax Không ảnh hưởng Giảm Giảm Giảm
Km Tăng Giảm Tăng Không ảnh hưởng
2.3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ [2]
Ta có thể tăng vận tốc của một phản ứng hóa học bằng cách tăng nhiệt độ của môi trường, hiện tượng này tuân theo định luật Vant-Hoff. Điều này có nghĩa là khi tăng nhiệt độ lên 10 lần thì tốc độ phản ứng tăng lên khoảng 1,5 đến 2 lần. Đối với phản ứng do enzym xúc tác cũng có thể áp dụng được quy luật này nhưng chỉ trong một phạm vi nhất định, vì bản chất enzym là protein. Khi ta tăng nhiệt độ lên
trên 40-50oC xảy ra quá trình phá hủy chất xúc tác. Mỗi enzym có một nhiệt độ tối
ưu khác nhau. Sau nhiệt độ tối ưu thì tốc độ phản ứng enzym xúc tác sẽ giảm.
2.3.5. Ảnh hƣởng của pH [2]
Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết chất nền và hoạt động của phân tử enzym, dẫn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH.
Đa phần các enzym bền trong khoảng 5 < pH < 9, nhiều enzym hoạt động rất mạnh ở môi trường pH trung tính và cũng có rất nhiều enzym hoạt động mạnh ở cả pH kiềm và trung tính.
Bản chất hóa học của thành phần dung dịch đệm cũng ảnh hưởng đến độ bền, hoạt động xúc tác của enzym.
Tóm lại, ngoài các yếu tố đã nói ở trên, còn có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng lên hoạt động xúc tác của enzym như: ánh sáng, chất hoạt hóa, sóng siêu âm, sự chiếu điện…
- 21 -
2.4. Giới thiệu về enzym α-glucosidase
Enzym α-glucosidase với những tên khác như maltase, glucoinvertase,
glucosidoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, nitrophenyl α-D- glucosidase, transglucosidase, α-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D- glucosidase, α-glucosidase hydrolase, α-1,4-glucosidase, thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzym xúc tác các phản ứng thủy phân).
Khi thức ăn được hấp thụ vào cơ thể thì các carbohydrat trong thức ăn được thủy phân thành những phân tử đường nhỏ hơn bởi những enzym trong ruột non.
Tiến trình phân hóa này đòi hỏi tụy tạng phải tiết ra enzym α-amylase dùng để phá
vỡ các phân tử carbohydrat lớn thành oligosaccharid. Enzym α-glucosidase ở màng
ruột non lại tiếp tục phân hoá các oligosaccharid thành các phân tử đường nhỏ hơn
nữa rồi mới thẩm thấu vào máu. Bằng cách kiềm chế hoạt động của enzym α-
glucosidase có thể làm giảm sự thủy giải của carbohydrat và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào mạch máu. [29]
α-amylase Tinh bột Saccharose (Glucose + Fructose) Maltose (Glucose + Glucose) Chất ức chế α-glucosidase Chất ức chế
Glucose Glucose Glucose Fructose
Glucose huyết tăng
2.5. Tác nhân ức chế enzym -glucosidase
Việc tìm kiếm các hợp chất ức chế enzym -glucosidase có ý nghĩa rất lớn trong các lĩnh vực như dược phẩm, thực phẩm… Đã có rất nhiều hợp chất được tìm thấy trong tự nhiên hoặc tổng hợp có khả năng ức chế enzym α-glucosidase. Tuy nhiên, những tác nhân ức chế enzym -glucosidase hiện nay thường gây nhiều phản ứng phụ. Vì vậy, việc tìm kiếm các hoạt chất có khả năng ức chế enzym
-glucosidase vẫn đang được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Thông thường, việc nghiên cứu các hoạt chất ức chế -glucosidase luôn bắt đầu từ các hợp chất có trong tự nhiên vì nguồn dược thảo rất phong phú, đa dạng và ít phản ứng phụ. Do đó, các nhà khoa học trên thế giới thường sử dụng những phương pháp sàng lọc hoạt tính ức chế enzym này để định hướng trong nghiên cứu. Nhiều nước đã công bố trên các tạp chí quốc tế về các cây thuốc có khả năng ức chế enzym - glucosidase với mục đích sử dụng trong lĩnh vực dược phẩm, cũng như đã cô lập được nhiều hợp chất có hoạt tính ức chế enzym -glucosidase từ nguồn dược thảo.
Hiện nay, các hợp chất ức chế enzym -glucosidase được chia thành các nhóm chính sau: disacccarit, iminosugar, thiosugar, pseudoaminosugar, carbasugar và các hợp chất không có liên kết glucosidic. Dưới đây liệt kê một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase.
2.5.1. Các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase từ tổng hợp [27]
Disaccarit
Nijibiose
- 23 -
Iminosugar
3-O-( -D-Glucopyranozyl)-1-deoxynojirimycin
Isofagomin Noeuromycin
Hình 1.17: Các hợp chất iminosugar ức chế enzym α-glucosidase
Carbasugar và pseudoaminosugar
Voglibose
Hình 1.18: Các hợp chất carbasugar và pseudoaminosugar ức chế enzym α-glucosidase
Thiosugar
X = O; S; Se; N Tetrahydroxyazepan
Hình 1.19: Các hợp chất thiosugar ức chế enzym α-glucosidase
- 25 - R R1 đến R4 (CH2)Ph Cl Ph R H N-p-coumaroyl-N'-feruloyputrescin CH3 N, N'-diferuloyputrescin
Hình 1.20: Các hợp chất không có liên kết glycosidic ức chế enzym α-glucosidase
2.5.2. Các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase cô lập tự nhiên [27]
Disaccarit
Kojibiose được cô lập từ dịch chiết xa kê năm 1953 bởi Ugalde, Staneloni, Leloir và các cộng sự có hoạt tính ức chế enzym -glucosidase. Kojibiose có nối
-(1 2) glycosidic được cô lập ra từ Aspergillus oryzae.
Dịch chiết từ hạt Mormodica charantia và từ trái Grifola frondosa cho hoạt tính ức chế -glucosidase và cô lập được D-(+)-trehalose. Trehalose có 2