Z1-α/2: Hệ số tin cậy 95% (=1,96)
2.2.11.Nội dung xét nghiệm
2.2.11.1 Xét nghiệm trực tiếp
* Lấy bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm tuỳ thuộc vào vị trí thương tổn. Thơng thường bệnh phẩm xét nghiệm tìm nấm Candida là:
- Lưỡi miệng: Dùng dao cùn lấy giả mạc trắng, và dùng tăm bơng ngốy họng - Da, móng và rãnh quanh móng: Dùng dao cùn cạo thương tổn da nhẵn, cắt khối sừng mủn dưới móng và cạo rãnh quanh móng.
- Bệnh phẩm là máu: phải tiến hành nuôi cấy
- Bệnh phẩm dịch não tuỷ: ly tâm lấy cặn để soi tươi, nhuộm soi, nuôi cấy
- Nếu là dịch âm đạo trong viêm âm hộ - âm đạo nghi do Candida: Mở mỏ vịt và lấy bệnh phẩm ở cùng đồ sau.
* Làm tiêu bản
- Bệnh phẩm ở da, niêm mạc lưỡi miệng và móng đem nhỏ KOH 20% và soi kính hiển vi quang học
- Dịch cùng đồ sau tiến hành nhuộm Gram hoặc soi trong Nacl 9‰ - Dịch não tuỷ:
+ Lấy cặn để nhuộm Gram hoặc soi tươi trong Nacl 9‰ + Dầm trong mực tàu, để yên tĩnh 2-3 phút
- Đờm: phết tiêu bản nhuộm Gram * Nhận định kết quả
+ Bào tử nấm men hình trịn hoặc bầu dục, kích thước 3-6- 10µm. Có rất nhiều tế bào men nẩy chồi, đôi khi thấy hiện tượng giả sợi nấm.
- Trên tiêu bản nhuộm Gram: Sử dụng kính hiển vi quang học vật kính dầu 100 Tế bào nấm men có chồi hoặc khơng, hình trịn hoặc bầu dục, đơi khi thấy sợi nấm hoặc giả sợi. Bắt màu Gram dương.
- Trên tiêu bản mực tầu thấy tế bào men nảy chồi hoặc khơng có vỏ dày, chiết quang. Hình ảnh đó sơ bộ định hướng tới Cryptococcus.
2.2.11.2 Nuôi cấy, định loại
- Môi trường: Sabouraud, Chloramphenicol (gentamycine), Actidion
- Bệnh phẩm sau khi lấy vô khuẩn, tiến hành cấy vào môi trường trên theo phương pháp ria cấy hoặc cấy điểm. Bệnh phẩm sau khi lấy phải cấy ngay.
- Ria cấy từ 2-3 ống, t°=25- 30°C hoặc 37°C, thời gian sau 24- 48h. * Đại thể
- Khuẩn lạc tròn, màu trắng kem, sền sệt, bề mặt trơn nhẵn, có một số chủng thô ráp, sần sùi. Khi để già tạo tua sợi đâm sâu xuống môi trường thạch (C.albicans).
* Vi thể
- Thay đổi tuỳ theo lồi. Nói chung, nấm men hình cầu, hình trịn hoặc bầu dục. Kích thước thay đổi. Tất cả đều sinh chồi và bào tử chồi có thể trịn hoặc thon dài. Thường xuất hiện sợi giả có thể ngắn hoặc dài, đơi khi uốn cong, chia nhánh. Sợi nấm thật thường dài, có thể xuất hiện bào tử màng dầy (95% C.albicans)
2.2.11.3 Chẩn đoán giống
- Dựa vào đại thể (đã nêu trên)
2.2.11.4 Chẩn đốn lồi
Đây là thử nghiệm nhằm chẩn đoán nhanh C.albicans. Tuy nhiên, chỉ mang tính giả định.
- Chuẩn bị:
+ Môi trường: Huyết thanh ngựa ( hoặc huyết thanh thỏ, ngi...) + K thut:
ã Ly pipet hỳt 200 àl huyt thanh cho vào ống tube thuỷ tinh đã hấp vơ khuẩn
• Dùng ăng chữ L lấy một lượng khuẩn lạc nhỏ bằng đầu ăng
• Hồ tan hồn tồn vào ống tube đã nhỏ sẵn huyết thanh • Đem ủ ở 37°C, thời gian khoảng 3h (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
• Lấy một giọt dung dịch đó nhỏ lên lam kính sạch, đậy lá kính đem soi dưới kính hiển vi quang học.
- Nhận định kết quả: Vật kính 10 nhận định sơ bộ, vật kính 40 khẳng định. + Xuất hiện các bào tử nấm men và sợi nấm ngắn nối với nhau, mọc về một phía của bào tử, trông giống như hiện tượng giá đậu lên mầm và thường xuất hiện với số lượng nhiều.
Thử nghiệm này dương tính gặp trong 97% các trừơng hợp là
C.albicans.
Chú ý:
- Tốt nhất nên dùng huyết thanh ngựa. Không nên dùng huyết thanh người, còn nếu dùng huyết thanh người cần chắc chắn khơng có kháng thể kháng nấm.
- Đọc kết quả trong vịng 3h, khơng nên để quá lâu hoặc đọc quá sớm. Bởi có thể gây nhầm lẫn khi nhận định kết quả.
- Thử nghiệm cịn cho kết quả âm tính nếu như chỉ thấy tồn tế bào nấm men - Bên cạnh đó, thử nghiệm cịn cho kết quả dương tính giả khi thấy có sự giới hạn giữa bào tử nấm men gắn với sợi nấm.
Kỹ thuật cấy trên lam
Mục đích: Quan sát bào tử màng dày và giả sợi
- Môi trường: Tự chuẩn bị môi trường thạch Bột ngô + Tween 80 - Phương pháp cấy trên lam:
+ Đun cách thuỷ ống mơi trường đến khi tan chảy hồn tồn thành dịch lỏng. + Đổ thạch lên lam kính d= 2cm, dùng que cấy “L” lấy một lượng khuẩn lạc bằng đầu ăng.
+ Cấy thành 1 đường ziczac (6-8 điểm) cách đều nhau giữa miếng thạch + Đậy lá kính vơ khuẩn
+ Đặt lam kính vào hộp lồng có sẵn giá đỡ là que thuỷ tinh hình chữ U + Đặt miếng bơng tẩm nước cất vào hộp lồng để tạo độ ẩm
+ Ủ trong tủ ấm t°= 25 - 30°C, đọc kết quả sau thời gian 24h-48h - Nhận định kết quả:
Ta thấy sự phát triển của sợi giả có thể rất mạnh mẽ. Khoảng 95% các trường hợp sợi giả sinh bào tử màng dày. Đó là những tế bào trịn, thành bào tử rất dầy, kích thước lớn 10-15 µm, thường sinh ra ở đầu sợi nấm. Đôi khi xuất hiện ở giữa hoặc cuối sợi nấm.
Hiện tượng sợi giả và bào tử màng dày gặp trong 95% C.albicans
Chú ý:
- Chúng tôi sử dụng môi trường Thạch bột ngô Tween 80 để tiến hành phương pháp nuôi cấy trên lam. Đây là một thử nghiệm quan trọng do đó cần mơi trường rất hữu ích để tạo được nhiều sợi và bào tử màng dày. Chúng tơi tìm hiểu thấy trong hạt ngơ hàm lượng các chất dinh dưỡng, chất xơ gấp 4-6 lần gạo và lúa mì.
- Nếu nấm men không sinh bào tử màng dày và sợi nấm giả có thể cần phải làm thêm các thử nghiệm khác.
- Không được tiến hành nuôi cấy trên lam nếu nghi ngờ là chủng nấm lưỡng hình nguy hiểm.
Mơi trường CHROM agar Candida
- Môi trường đổi màu: Tự chuẩn bị.
- Cách tiến hành: Ria cấy phân vùng khuẩn lạc nấm men lên đĩa thạch - Đọc kết quả sau 2 ngày: Nhận định được ngay các loài Candida bởi mỗi loài cho một màu sắc đặc trưng. Độ nhạy và độ đặc hiệu cao 95%.
Rất hữu ích trong việc phát hiện các chủng nấm đồng nhiễm trên một
mẫu bệnh phẩm.
Lên men đường
+ Auxacolor( Kit Bio-rad): Nhằm đánh giá khả năng sử dụng 13 loại đường của các chủng nấm men, biểu hiện bằng sự thay đổi màu sắc của chất chỉ thị pH có trong mơi trường thử nghiệm. Thử nghiệm dương tính khi màu chuyển từ tím sang vàng, cịn âm tính cho màu tím.
Ngồi ra, cịn phát hiện sự kháng Actidion của nấm men và phát hiện Enzym phenoloxydase của C.neoformans. Thử nghiệm cho phép phát hiện 25 chủng nấm men gây bệnh thường gặp.
Một số lưu ý (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bệnh phẩm sau khi lấy phải cấy ngay
Test ống mầm mang tính giả định nên có thể dương tính giả Bệnh nhân khơng dùng thuốc kháng nấm trước đó 3 ngày.
* Xác định độ nhạy cảm của chủng nấm với các kháng sinh chống nấm bằng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuyếch tán trên thạch.