2.2.1. Xác định độ ẩm
Để xác định độ ẩm của trà dùng phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi. Nhiệt độ sấy nằm trong khoảng 100 – 105oC
Cách tiến hành:
+Lấy 1 đĩa thuỷ tinh đem sấy khô đến khối lượng không đổi, cân được khối lượng W
+Lấy khoảng 10 g trà xanh cho vào đĩa thuỷ tinh đã sấy khô, cân được khối lượng W1
+Cho đĩa thuỷ tinh và trà vào tủ sấy ở 105oC. Sấy cho đến khi cân đến khối lượng không đổi. Khi lấy ra khỏi tủ sấy phải cho vào bình hút ẩm khoảng 30 phút. Cân được khối lượng W2.
Tính kết quả
Độ ẩm được tính theo công thức: X = *100 1 2 1 W W W W − − X : độ ẩm của trà (%)
W: Khối lượng của đĩa thuỷ tinh khi sấy khô (g)
W1: Khối lượng của đĩa thuỷ tinh và trà trước khi sấy (g) W2: Khối lượng của đĩa thuỷ tinh và trà sau khi sấy khô( g)
2.2.2. Hàm lượng chất hoà tan trong dịch trích
Nguyên tắc: Sau khi chiết các chất hoà tan trong dịch trích, lấy một thể tích xác định của dịch trích đem đun các thuỷ và sấy khô đến khối lượng không đổi
Tiến hành : Dùng 7,5 g nguyên liệu, trích 3 lần, mỗi lần bằng 150 ml dung môi, sau lần trích thứ 3 thì dịch trích không bị chuyển sang màu xanh khi thử bằng FeCl3 , do đó có thể kết luận các thành phần Polyphenol đã được trích ra hết. Dịch trích của cả 3 lần được định mức lên 500 ml, sau đó lấy 50 ml cho vào cốc thuỷ
tinh đã sấy khô và cân trước. Đun cách thuỷ và cho vào tủ sấy, sấy trong 4 h ở 100 – 105oC. Sau đó đem cân, lặp lại cho đến khi khối lượng không đổi.
mo : Khối lượng của cốc thuỷ tinh khi sấy khô (g)
m1 : Khối lượng của cốc thuỷ tinh và chất hoà tan trong cồn khi đã sấy khô(g )
m : Khối lượng trà đem trích ly ; m = 7,5 g Y = V m v m m o * 1 − V : Thể tích tổng của dịch trích (ml) v : Thể tích lấy đi sấy khô (ml)
2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng
Nguyên tắc : Folin Ciocalteu là chất rất nhạy, dễ phản ứng với các hợp chất khác, trong trường hợp này là các Polyphenol. Chúng dễ dàng phản ứng với các Polyphenol để tạo thành hợp chất có màu xanh khi có mặt Na2CO3.
Dụng cụ và Hoá chất
+Máy UV-VIS ( 6505 UV/VIS Spectrophotometer , Jenway) +Folin Ciocalteu
+Dung dịch Na2CO3 bão hoà Thực hiện
Lấy 0,5 ml mẫu cho vào ống nghiệm, sau đó cho vào đó 4,5 ml nước cất, lắc đều. Cho nhanh vào ống nghiệm 0,2 ml Folin và 0,5 ml Na2CO3 bão hoà, lắc đều. Tiếp tục vào ống nghiệm 4,3 ml nước cất, lắc đều. Để trong 1 h, sau đó đem đi đo độ hấp thu ở bước sóng 725 nm, thực hiện đồng thời một mẫu trắng.
Tiến hành tương tự như trên với dung dịch chuẩn và lập đồ thị đường chuẩn C = f(A). Ở đây, dùng acid Gallic để lập đường chuẩn.
2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng Flavonoid tổng
Nguyên tắc : Nhóm Flavonoid có khả năng tạo phức với Al3+ và phức này chuyển thành màu hồng trong môi trường kiềm.
Dụng cụ và hoá chất:
+Máy UV-VIS ( 6505 UV/VIS Spectrophotometer , Jenway) +Dung dịch NaNO2 5%
+Dung dịch AlCl3 10% +Dung dịch NaOH 1N
( Sử dụng NaNO2, AlCl3, NaOH của Trung Quốc) Thực hiện
Lấy 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 3 ml nước cất, lắc đều. Sau đó thêm vào 0,3 ml NaNO3 5%, lắc đều, để yên trong 5 phút, tiếp tục cho vào 0,3 ml AlCl3
10%, lắc đều, để yên trong 6 phút. Sau đó cho vào 2 ml NaOH 1N lắc đều , cuối cùng, thêm 2,4 ml nước cất, lắc kỹ. Sau đó đem đi đo độ hấp thu ở bước sóng 510 nm, thực hiện đồng thời với một mẫu trắng.
Tiến hành tương tự như trên với dung dịch chuẩn và lập đồ thị đường chuẩn C = f(A). Ở đây, dùng epicatechin để lập đường chuẩn.
2.2.5. Tính kết quaÛ
Hàm lượng Polyphenol hay Flavonoid theo % khối lượng nguyên liệu khô được xác định theo công thức.
Z = K X M V C * ) 100 ( * −
Z: Hàm lượng Polyphenol hoặc Flavonoid ( % nguyên liệu khô)
C: Nồng độ Polyphenol hoặc Flavonoid có trong dịch trích xác định từ đường chuẩn
M: Khối lượng trà đem đi trích (g) X: Độ ẩm nguyên liệu
K: Hệ số pha loãng
2.2.6. Xác định hàm lượng tổng Polyphenol và tổng Flavonoid
Lấy 7,5 g trà, trích bằng 150 ml dung môi cồn 60o, sau đó gạn dịch trích ra tiếp tục cho vào 150ml dung môi và trích , tiếp tục như vậy cho đến khi thử bằng FeCl3 mà dịch trích không cho màu xanh nữa thì dừng. Lấy toàn bộ dịch trích đem định mức, pha loãng và tạo phức, đo độ hấp thu. Từ đó tính ra hàm lượng tổng Polyphenol và tổng Flavonoid.
Hiệu suất trích
Hàm lượng Polyphenol trích được*100 H% (Polyphenol) = _______________________________ Hàm lượng tổng Polyphenol
Hàm lượng Flavonoid trích được*100 H% (Flavonoid) = _______________________________ Hàm lượng tổng Flavonoid
2.2.7. Đo các chỉ số màu L*a*b
Dịch trích trong phần bảo quản từng ngày sẽ được lấy ra và đo các chỉ số L*a*b
Dựa vào sự thay đổi các chỉ số trên để kết luận chất chống oxy hoá nào bảo vệ tốt hơn, từ đó lựa chọn ra chất chống oxy hoá thích hợp.
Trên đồ thị màu sắc có 3 trục L, a, b
L :Thay đổi từ 0 – 100 đặc trưng cho sự chuyển màu từ tối đến sáng,
a : Thay đổi từ –a đến + a tương ứng với sự biến đổi từ màu xanh lục sang màu đỏ
b :Thay đổi từ –b đến + b tương ứng với sự biến đổi từ màu xanh dương sang màu vàng,
CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VAØ BAØN LUẬN
3.1. LẬP ĐƯỜNG CHUẨN
* Đường chuẩn của Polyphenol sử dụng acid Gallic.
C-ppm 0 50 100 200 300 400 500
A 0 0,248 0,554 1,04 1,455 2,183 2,613
Hình 3.1 . Đồ thị đường chuẩn phương pháp đo Polyphenol tổng
* Đường chuẩn của Flavonoid sử dụng epicatechin
C(ppm) 0 51,2 102,4 153,6 179,2 204,8 230,4 A 0 0,16 0,279 0,416 0,471 0,529 0,592
Hình 3.2 . Đồ thị đường chuẩn đo Flavonoid tổng
Kết luận : Mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thu là mối quan hệ tuyến tính, và với các giá trị R2 như trên thì hai đường chuẩn trên hoàn toàn có thể sử dụng để đo hàm lượng Polyphenol tổng và Flavonoid tổng.
Kết quả khảo sát hàm lượng các chất trích được bằng vi sóng và trích thường Phương pháp trích Flavonoid (% kl. khô)(PP so màu) Polyphenol (% kl. khô)(PP so màu) Catechin (% kl. khô)(HPLC) Vi sóng 7,196 18,584 10,753 Trích thường 7,006 18,148 6,634
Kết quả trên có sự khác biệt vì phương pháp so màu chỉ là phương pháp so sánh giữa các mẫu với nhau. Phương pháp đó không phản ánh được chính xác hàm lượng của các chất. Vì trong quá trình tạo phức, có một số cấu tử lạ cũng tạo phức làm nhiễu đến kết quả đo. Do đó, phải kết hợp cả hai phương pháp đo Polyphenol và Flavonoid bằng so màu .
3.2. KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA NGUYÊN LIỆU 3.2.1. Xác định độ ẩm
Khối lượng đầu (g)
Khối lượng cuối (g)
Độ ẩm (%)
11,37 10,79 5,1
Vậy độ ẩm của trà là 5,1%.
Kết luận : Đối với trà xanh thành phẩm thì độ ẩm là một trong các thông số quan trọng. Nếu như độ ẩm cao hơn giá trị cho phép thì các thành phần trong trà đặc biệt là Polyphenol dễ bị phân huỷ. Trên các sản phẩm trà xanh đều quy định độ ẩm ≤ 7% . Với độ ẩm 5,1% như trên thì nguyên liệu trên đạt yêu cầu tồn trữ để sử dụng trong quá trình thí nghiệm.
3.2.2. Hàm lượng chất hoà tan trong dịch trích
Dung môi V ( dịch trích) (ml) v(để sấy khô)(ml) Hàm lượng (% nguyên liệu) Cồn 60o 500 50 46,67
Kết luận : Thành phần chủ yếu của chất chiết ngoài hợp chất Polyphenol còn rất nhiều các chất khác như chlorophyl, các protein…cũng ảnh hưởng nhiều đến chất lượng trà. Với dung môi là cồn 60o thì có thể hoà tan được rất nhiều các chất trong trà.
3.2.3. Hàm lượng tổng Polyphenol và tổng Flavonoid trong trà
Trích kiệt :Thực hiện 2 lần trích kiệt, sau đó lấy kết quả trung bình, Trong mỗi lần trích kiệt: Trích 3 lần, mỗi lần bằng 150 ml dung môi, m = 7,5 g, sau lần thứ 3 thì dịch trích đem thử với FeCl3 không còn cho màu xanh nữa. Do đó, có thể kết luận, Polyphenol đã được trích ra hết.
A m(mg) Hàm lượng (%kl.khô)
0,253 564,47 7,931
* Polyphenol:
3.3. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY3.3.1. Ảnh hưởng của thời gian chiếu vi sóng 3.3.1. Ảnh hưởng của thời gian chiếu vi sóng
Tiến hành trích trong các điều kiện sau: + Công suất lò : 800W
+ Dung môi : Cồn 60o
+Tỷ lệ nguyên liệu dung môi 1:20 ( 7,5 g: 150 ml) +Thời gian ngâm :0 phút
Flavonoid Thời gian (phút) Độ hấp thu A Hàm lượng (%kl.khô) Hiệu suất trích 1 0,246 3,073 38,753 2 0,369 4,874 61,451 3 0,434 5,825 73,446 4 0,496 6,732 84,888 5 0,511 6,952 87,656 6 0,518 7,054 88,948 7 0,522 7,113 89,686 8 0,527 7,186 90,609 9 0,536 7,318 92,269 10 0,538 7,347 92,639 A m(mg) Hàm lượng (%kl.khô) 0,655 1562,382 21,951
Hình 3.3 .Ảnh hưởng của thời gian chiếu vi sóng đến hàm lượng Flavonoid Polyphenol Thời gian (phút) Độ hấp thu A Hàm lượng (%kl.khô) Hiệu suất trích 1 0,684 9,168 41,766 2 0,979 13,078 59,579 3 1,125 15,013 68,395 4 1,282 17,094 77,875 5 1,293 17,240 78,539 6 1,326 17,678 80,531 7 1,334 17,784 81,014 8 1,352 18,022 82,101 9 1,365 18,195 82,886 10 1,386 18,473 84,154
Hình 3.4 . Ảnh hưởng của thời gian chiếu vi sóng đến hàm lượng Polyphenol
Hình 3.5. Hàm lượng Flavonoid và Polyphenol trích được theo thời gian chiếu vi sóng
Kết luận : Thời gian chiếu vi sóng là một trong những thông số rất quan trọng của quá trình trích ly. Theo kết quả trên thì càng kéo dài thời gian thì hiệu quả trích ly càng tăng nhưng hiệu quả chỉ tăng nhanh từ phút thứ nhất đến phút thứ 6 (tương ứng với thời gian trích là 15 phút) , sau đó sẽ tăng nhưng rất chậm vì lúc này phần lớn các chất chiết đã hoà tan vào dịch trích làm cho nồng độ dịch trích tăng lên, nồng độ chất hoà tan trong trà giảm xuống. Khi nồng độ của chất hoà tan trong pha rắn và pha lỏng không chênh lệch nhau quá nhiều, nghĩa là đạt gần tới trạng thái cân bằng thì động lực quá trình khuếch tán lúc đó còn rất thấp. Khi đó, dù có kéo dài thời gian chiếu vi sóng thì lượng chất hoà tan trích được cũng tăng lên không đáng kể.
Do đó, nên chọn thời gian chiếu vi sóng là 6 phút là tốt nhất vừa để tiết kiệm năng lượng, thời gian vừa tránh hiện tượng các catechin có thể bị oxy hoá và kết hợp với nhau tạo thành các dime, polyme vì bị nhiệt độ cao trong thời gian kéo dài.
3.3.2. Ảnh hưởng của công suất lò vi sóng
Tiến hành trích trong các điều kiện sau: +Thời gian chiếu vi sóng: 6 phút
+Dung môi : Cồn 60o
+Tỷ lệ nguyên liệu dung môi 1:20 ( 7,5 g: 150 ml) +Thời gian ngâm :0 phút
+Khảo sát ở 3 chế độ công suất 450W, 650W, 800W
Flavonoid Công suất (W) Độ hấp thu A Hàm lượng (%kl.khô) Hiệu suất trích 450 0,452 6,088 76,768 650 0,466 6,438 81,179 800 0,514 7,141 90,037
Hình 3.6 . Ảnh hưởng của công suất lò đến hàm lượng Flavonoid Polyphenol Công suất (W) Độ hấp thu A Hàm lượng (%kl.khô) Hiệu suất trích 450 1,116 14,894 67,851 650 1,188 15,849 72,199 800 1,357 18,089 82,403
Hình 3.7. Ảnh hưởng của công suất lò đến hàm lượng Polyphenol
Kết luận: Công suất lò có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả quá trình trích ly. Với cùng một thời gian chiếu vi sóng là 6 phút thì công suất 450 W cho hiệu quả thấp nhất còn công suất 800 W cho hiệu quả cao nhất. Lí do là ở công suất lớn quá trình gia nhiệt nhanh sẽ làm cho dung môi thấm vào trong trà hoá hơi đột ngột phá vỡ thành tế bào giải phóng các thành phần hoà tan vào trong dung môi. Ở công suất nhỏ, nếu muốn đạt được hiệu suất như ở 800 W thì thời gian trích sẽ phải kéo dài. Vì vậy, ở đây ta chọn công suất lò vi sóng là 800 W .
3.3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu : dung môi
Tiến hành trích trong các điều kiện sau: +Thời gian chiếu vi sóng: 6 phút
+Dung môi : Cồn 60o
+Thời gian ngâm :0 phút
+Chỉ thay đổi khối lượng nguyên liệu, giữ nguyên thể tích dung môi để đảm bảo thời gian chiếu vi sóng
Flavonoid
Tỷ lệ
Nguyên liệu : dung môi
Độ hấp thu A Hàm lượng (%kl.khô) Hiệu suất trích 1:10 0,404 5,386 67,910 1:15 0,302 5,839 73,631 1:20 0,511 6,952 87,656 1:25 0,417 6,970 87,887 1:30 0,843 7,086 89,354
Polyphenol
Tỷ lệ
Nguyên liệu : dung môi
Độ hấp thu A Hàm lượng (%kl.khô) Hiệu suất trích 1:10 1,186 15,822 72,078 1:15 0,876 17,570 80,039 1:20 1,397 18,619 84,818 1:25 1,14 19,015 86,625 1:30 2,385 19,029 86,685
Hình 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu :dung môi lên hàm lượng Polyphenol
Kết luận : Từ đồ thị trên ta thấy khi tăng tỷ lệ nguyên liệu dung môi lên thì hiệu quả trích ly càng tăng. Nhưng từ tỷ lệ 1 : 20 trở nên thì hiệu quả có tăng nhưng rất chậm. Đó là vì trong quá trích ly, lúc đầu do sự mất cân bằng về nồng độ giữa nguyên liệu và dung môi nên các chất hoà tan sẽ khuếch tán từ nguyên liệu
vào trong dung môi. Nồng độ của dịch trích sẽ không tăng nữa khi xảy ra trạng thái cân bằng về nồng độ của dịch trích và của nguyên liệu.
Với tỷ lệ 1 : 20 thì thể tích dung môi đó đủ để hoà tan các chất chiết cho đến trạng thái gần cân bằng giữa nồng độ của dịch trích và của nguyên liệu. Nếu giảm khối lượng nguyên liệu xuống thì nồng độ của dịch trích sẽ trở nên loãng hơn do đó hoà tan được nhiều chất chiết hơn. Nhưng với những kết quả trên thì hiệu quả tăng thêm không đáng kể vì với tỷ lệ 1 : 20 đã đủ hoà tan được một lượng lớn chất hoà tan, khi tăng tỷ lệ lên nữa cũng chỉ hoà tan thêm một lượng nhỏ chất hoà tan.
Chọn tỷ lệ 1 : 20 là kinh tế nhất, vừa sử dụng vừa phải lượng dung môi, vừa tiết kiệm thời gian, năng lượng để cô đặc sau này mà vẫn đạt hiệu suất trích khá cao.
3.3.4. Ảnh hưởng của độ cồn của dung môi
Tiến hành trích trong các điều kiện sau: +Thời gian chiếu vi sóng : 6 phút
+Công suất lò : 800W
+Tỷ lệ nguyên liệu dung môi 1:20 ( 7,5 g: 150 ml) +Thời gian ngâm :0 phút
Flavonoid: Độ cồn Độ hấp thu A Hàm lượng (%kl.khô) Hiệu suất trích 0 0,365 4,815 60,713 40 0,476 6,440 81,197 50 0,508 6,908 87,102 60 0,528 7,201 90,793 70 0,514 6,996 88,210 80 0,484 6,557 82,673
Hình 3.10 . Ảnh hưởng của độ cồn lên hàm lượng Flavonoid Polyphenol Độ cồn Độ hấp thu A Hàm lượng (%kl.khô) Hiệu suất trích 0 0,962 12,853 58,552 40 1,215 16,206 73,829 50 1,324 17,651 80,411 60 1,385 18,460 84,094 70 1,367 18,221 83,007 80 1,18 15,742 71,716
Hình 3.11 . Ảnh hưởng của độ cồn lên hàm lượng Polyphenol
Kết luận: Các Polyphenol đều dễ tan trong nước nóng, rượu, aceton, ethyl acetate, không tan trong benzene, chloroform. Do đó, khi sử dụng dung môi cồn thì trích ly đựơc nhiều Polyphenol hơn đồng thời cồn có giá không quá cao và không độc hại. Ở đây, cồn 60o cho hiệu quả trích ly cao nhất so với cồn có nồng độ cao hoặc thấp hơn. Điều này có thể giả thích là do cồn phân cực yếu hơn nước, khi nồng độ cồn thấp thì sự phân cực cao (do có chứa nước nhiều hơn) sẽ ức chế sự hoà tan của một số thành phần có độ phân cực tương đối thấp. Còn nếu nồng độ cồn cao sẽ không tạo đủ độ phân cực thích hợp, khi đó sẽ khó hoà tan một số thành phần có độ phân cực mạnh và dung môi như vậy sẽ hấp thu vi sóng khá yếu. Vì vậy, ta nên chọn dung môi là cồn 60o.
3.3.5. Ảnh hưởng của thời gian ngâm
Tiến hành trích trong các điều kiện sau: +Thời gian chiếu vi sóng : 6 phút
+Dung môi : Cồn 60o
+Tỷ lệ nguyên liệu dung môi 1:20 ( 7,5 g: 150 ml)
Flavonoid Thời gian ngâm (phút) Độ hấp thu A Hàm lượng (%kl.khô) Hiệu suất trích 0 0,523 7,127 89,870 30 0,539 7,362 92,823 60 0,538 7,347 92,639 90 0,541 7,391 93,192 120 0,54 7,376 93,008