Các chỉ tiêu theo dõi - Phương pháp nghiên cứu- 123docz.net

PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.3 Các chỉ tiêu theo dõi

3.3.3.1 Chỉ tiêu môi trường

- Nhiệt độ và pH được đo cuối mỗi chu kỳ nuôi. - Kiểm tra các yếu tố NO2, TAN 4 ngày/ lần.

3.3.3.2 Chỉ tiêu vi khuẩn

Kiểm tra mật số vi khuẩn tổng, Bacillus, và Vibrio cuối mỗi chu kỳ nuôi.

3.3.3.3 Chỉ tiêu sinh học

Xác định hàng ngày mật số luân trùng, tỷ lệ luân trùng mang trứng.

3.4 Phương pháp thu thập, tính tốn và xử lý số liệu 3.4.1 Chỉ tiêu môi trường 3.4.1 Chỉ tiêu môi trường

Các chỉ tiêu môi trường được thu vào cuối mỗi chu kỳ nuôi.

- Nhiệt độ được đo bằng nhiệt kế thủy ngân.

- pH đo bằng máy đo pH.

Chỉ tiêu Phương pháp phân tích

TAN Indo-phenol blue N-NO2- Dianozium

3.4.2 Chỉ tiêu vi khuẩn

3.4.2.1 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn

Nuôi tăng sinh vi khuẩn Bacillus

- Môi trường nuôi tăng sinh là môi trường Luria Bertani (LB).

- Vi khuẩn Bacillus được cho vào mơi trường LB, cho vào bình tam giác có gắn

sục khí, ở 30oC trong vịng 24 giờ.

Sau khi nuôi tăng sinh xác định mật độ vi khuẩn bằng 2 phương pháp.

• Phương pháp đếm trên đĩa thạch với môi trường chuyên biệt cho giống

• Phương pháp đo OD: sau khi ni tăng sinh sử dụng máy đo quang phổ tại bước sóng 550nm để xác định giá trị OD. Mẫu đối chứng khơng có vi khuẩn được đo đầu tiên và có giá trị bằng 0. Dung dịch huyền phù vi khuẩn cần đo sẽ có giá trị OD trong khoảng 0,125 - 1,25. Theo tiêu chuẩn Mac Farland giá trị OD bằng 1 tương ứng mật độ vi khuẩn 1,2 × 109 tế bào/mL.

Mật độ vi khuẩn được tính theo cơng thức

Mật độ vi khuẩn (tế bào/mL) = 1200×106×OD×Độ pha loãng Bảng 3.1: Bảng giá trị OD550nm

Giá Trị OD550 0,125 0,250 0,500 0,750 1,000 1,250

Mật Độ Vi Khuẩn (106 CFU/mL)

150 300 600 900 1200 1500

3.4.2.2 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn Bacillus

Thao tác chuẩn bị: các ống falcon, các ống nghiệm chứa 9 mL nước muối sinh lý 0,85% tiệt trùng ở 121oC trong 15 - 20 phút để pha loãng mẫu. Mẫu vi sinh sẽ được thu 4 ngày/lần.

Tại phịng thí nghiệm lấy mẫu nước ra khỏi tủ mát, để ở nhiệt độ phòng. Mở nắp dụng cụ chứa mẫu trong tủ cấy tiệt trùng, chuyển 1 mL mẫu nước sang các ống nghiệm chứa 9 mL nước muối sinh lý đã tiệt trùng, trộn đều bằng máy 1 phút. Ta được mẫu có độ pha lỗng 10-1. Từ mẫu này chuyển 1 mL dung dịch sang ống nghiệm khác chứa 9 mL nước muối sinh lý được độ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng theo cách này đến khi đạt được độ pha lỗng cần phân tích, bắt đầu từ độ pha loãng 10-2.

Tất cả các ống nghiệm vừa pha loãng được sấy ở 80oC trong 20 phút rồi lấy ống nghiệm ra để nguội. Sau đó dùng micropipete hút 100 µL dung dịch vi khuẩn cho vào các đĩa chứa môi trường chuyên biệt cho giống Bacillus, rồi dùng que thuỷ

tinh tán đều đến khi mẫu khô. Ủ ở 28oC trong 24 – 48 giờ. Mỗi mẫu nước cần chọn 2 độ pha loãng khác nhau, mỗi độ pha loãng lập lại 3 lần.

Sau khi ủ kiểm tra môi trường nuôi cấy để xác định số khuẩn lạc dao động từ 20 đến 200. Số khuẩn lạc tổng cộng được đếm trên những đĩa petri có số khuẩn lạc > 20 và < 200 và được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc/mL nước.

3.4.2.3 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn tổng và vi khuẩn Vibrio

Dùng micropipete hút 100 µL dung dịch vi khuẩn cho vào các đĩa chứa môi trường TCBS chuyên biệt cho giống Vibrio và môi trường NA chuyên biệt cho

tổng vi khuẩn, dùng que thuỷ tinh tán đều đến khi mẫu khô. Ủ ở 28oC trong 24 – 48 giờ. Mỗi mẫu nước cần chọn 2 độ pha loãng khác nhau, mỗi độ pha loãng lập lại 3 lần.

* Cơng thức tính mật độ vi khuẩn:

Số tế bào/mL (CFU/ mL) = số khuẩn lạc × độ pha lỗng × 10 3.4.3 Chỉ tiêu sinh học

Luân trùng sẽ được đếm mỗi ngày để xác định tỷ lệ sống. Mật độ luân trùng được xác định hằng ngày bằng cách sử dụng micropipet 100 µL, cố định và nhuộm màu bằng Lugol. Sau đó đếm trên kính lúp, không đếm những con không bắt màu Lugol (luân trùng chết).

- Tỷ lệ sống: xác định theo công thức

Tỷ lệ sống (%) = (Nc/No) x 100

Trong đó Nc: Số luân trùng lúc kết thúc thí nghiệm No: Số luân trùng lúc bắt đầu thí nghiệm - Hệ số trứng: HST(%) = n/N

Trong đó n: Số cá thể luân trùng mang trứng N: Tổng số luân trùng đếm

3.4.4 Xử lý số liệu

Số liệu đã thu thập được xử lý sơ bộ với chương trình Excel và xử lý thống kê bằng phần mềm Statistica 5.0; sử dụng phép thử LSD. So sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức (ANOVA).

28.0 28.5 29.0 29.5 30.0 30.5 31.0

Chu kỳ 1 Chu kỳ 2 Chu kỳ 3 Chu kỳ 4

Chu kỳ thu mẫu

o C ĐC B 37 B 41 B 67

PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Thí nghiệm I: Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus lên sự tăng

trưởng của quần thể luân trùng

4.1.1 Biến động các yếu tố môi trường 4.1.1.1 Nhiệt độ 4.1.1.1 Nhiệt độ

Do các thí nghiệm được bố trí trong cùng điều kiện mơi trường nên kết quả nghiên cứu về nhiệt độ cho thấy rằng nhiệt độ ít biến động, nhìn chung nhiệt độ dao động trong khoảng 29,1 - 30,53oC được thể hiện qua Hình 4.1, và nhiệt độ giữa các nghiệm thức khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05), nhiệt độ trung bình giữa các nghiệm thức là 29,81 oC, nhiệt độ này hồn tồn thích hợp cho sự tăng trưởng của luân trùng vì theo Fulks (1991) nhiệt độ dao động thích hợp cho luân trùng là 20 – 30oC.

Hình 4.1 Biến động nhiệt độ trong thí nghiệm

4.1.1.2 Giá trị pH

Trong suốt thời gian nghiên cứu nhìn chung pH dao động khơng đáng kể giữa các chu kỳ của tất cả các nghiệm thức và khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Qua Hình 4.2 cho thấy pH đạt giá trị trung bình là 6,96 và dao động trong khoảng 6,87 - 7,07. pH thấp nhất là ở chu kỳ 4 của nghiệm thức B37 (6,57), cao nhất là ở chu kỳ 1 của nghiệm thức ĐC (7,4). pH có xu hướng giảm dần qua các chu kỳ thu mẫu, có thể là do cuối thí nghiệm lượng tảo dư thừa từ quá trình cho ăn bắt đầu phân hủy, làm gia tăng lượng CO2 dẫn đến pH giảm nhẹ, giá trị pH phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó sự hấp thu nguồn đạm khác nhau cũng dẫn đến sự biến đổi pH của mơi trường có tảo. Theo Oh-hama (1986), trích bởi Trần

6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6

Chu kỳ 1 Chu kỳ 2 Chu kỳ 3 Chu kỳ 4

Chu kỳ thu mẫu

p H ĐC B 37 B 41 B 67

Sương Ngọc (2003), thì sự hấp thụ N-NO3- sẽ dẫn đến pH tăng trong khi tế bào tảo hấp thụ N-NH+4 sẽ dẫn đến pH giảm. Nhưng nhìn chung giá trị pH này không ảnh hưởng lớn đến luân trùng, vì theo Epp và Winston (1978) hoạt động bơi lội và hô hấp của luân trùng hầu như không thay đổi khi pH trong khoảng 6,5 - 8,5 (trích bởi Nogrady 1993), và chỉ suy giảm khi pH dưới 5,6 hoặc trên 8,7 (Snell, 1987 trích bởi Nogrady 1993). pH chỉ có ảnh hưởng gián tiếp đến luân trùng qua nồng độ ion amonia, khoảng pH thích hợp có thể phụ thuộc vào thức ăn (Furukawa và Hidaka, 1973 trích bởi Fulks, 1991).

Hình 4.2 Biến động pH trong thí nghiệm

4.1.1.3 TAN

Hàm lượng TAN chính là tổng hàm lượng NH4+,NH3 có trong mơi trường nước và được gọi là tổng đạm amơn. Hàm lượng TAN trong mơi trường nước có liên quan đến mật số các vi khuẩn chuyển hố đạm. Qua Hình 4.3 cho thấy hàm lượng TAN ở các nghiệm thức đều có khuynh hướng tăng nhanh và rất cao, hàm lượng TAN trung bình thấp nhất là ở nghiệm thức đối chứng (16,68 ± 3,65) và cao nhất là ở nghiệm thức B67 (35,53± 3,46) và khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nghiệm thức đối chứng và các nghiệm thức còn lại qua các chu kỳ thu mẫu (p<0,05). Ở chu kỳ 1 hàm lượng TAN ở ĐC thấp nhất (11,6 mg/L), hàm lượng TAN cao nhất là ở chu kỳ 4 của nghiệm thức B41 (44,6 mg/L). Nhìn chung hàm lượng TAN của các nghiệm thức tăng dần về cuối thí nghiệm do q trình tích lũy dinh dưỡng, vì thế nó sẽ làm sản sinh ra một lượng lớn đạm ammonia, hàm lượng TAN tăng theo ngày nuôi và mật độ ni, khi mật độ ln trùng càng cao thì lượng thức ăn cho luân trùng càng nhiều, sự tích tụ và phân hủy của lượng thức ăn dư thừa và chất thải của luân trùng sẽ làm tăng hàm lượng TAN trong thí nghiệm.

a a a b b b b b b b b b b b b 0 10 20 30 40 50

Chu kỳ 1 Chu kỳ 2 Chu kỳ 3 Chu kỳ 4

Chu kỳ thu mẫu

m g /L ĐC B 37 B41 B67 a

Nhìn chung các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn vào thì hàm lượng TAN luôn lớn hơn hoặc bằng so với nghiệm thức đối chứng, nguyên nhân là do sự phân hủy vật chất hữu cơ của vi khuẩn có trong mơi trường nước nên đã làm hàm lượng TAN tăng lên. Theo Hirata và Nagata (1982) thì chất thải bài tiết của luân trùng phần lớn là ammonia dưới dạng hòa tan chủ yếu là ammonia và ure nên khi mật độ luân trùng càng cao thì TAN càng cao. Trong suốt mỗi chu kỳ ni hồn tồn khơng thay nước, chính vì vậy mà tổng đạm amon ln ở mức cao và tăng dần về cuối thí nghiệm, và với thức ăn cho luân trùng là tảo Chlorella, nên một phần ion NH4+ (một dạng phân đạm ưa chuộng của thực vật) đã được tảo hấp thu, nhưng kết quả pH và nhiệt độ luôn ở mức thấp, do đó việc NH3 được hình thành đến mức ảnh hưởng đến luân trùng là chưa xảy ra. Theo Lawson (1995) thì hàm lượng NH3 thích hợp trong ni thủy sản phải nhỏ hơn 0,02 mg/L, thậm chí nhỏ hơn 0,013 mg/L (Timmon và ctv, 2002).

Hình 4.3 Biến động TAN trong thí nghiệm

4.1.1.4 Nitrite (NO2- )

NO2- sinh ra do q trình oxy hóa NH4+ dưới tác động của vi khuẩn, là sản phẩm trung gian của q trình nitrate hóa khi có sự tham gia của oxy, nó cũng là tác nhân gây độc cho động vật thủy sản. Trong suốt thí nghiệm NO2- của các nghiệm thức biến động từ 0,03 - 0,23 mg/L, qua Hình 4.4 cho thấy ở chu kỳ 2 thì NO2- ở nghiệm thức B41 khác biệt có ý nghĩa thống kê so với B37 và B67. NO2- ở chu kỳ 3 có khác biệt ý nghĩa thống kê giữa nghiệm thức B37 với các nghiệm thức còn lại (p<0,05). Hàm lượng nitrite tương đối thấp thì hầu như khơng ảnh hưởng đến đời sống vật nuôi, và với hàm lượng nitrite trung bình của tất cả các nghiệm thức là

a a c a c a a a b a d a a b a a 0.0 0.1 0.1 0.2 0.2 0.3

Chu kỳ 1 Chu kỳ 2 Chu kỳ 3 Chu kỳ 4

Chu kỳ thu mẫu

m g /L ĐC B 37 B 41 B 67

0,12 mg/L thì hồn tồn không gây hại đối với luân trùng. Theo Groeneweg và Schluter (1981) hàm lượng NO2- từ 10 - 20 mg/L thì không gây độc cho luân trùng.

Hình 4.4 Biến động NO2- trong thí nghiệm

4.1.2 Biến động mật độ vi khuẩn

4.1.2.1 Biến động mật độ vi khuẩn tổng

Kết quả phân tích cho thấy mật độ vi khuẩn tổng đạt cao nhất là ở chu kỳ 4 của nghiệm thức ĐC (14,6×104 CFU/mL), và thấp nhất là ở chu kỳ 1 của nghiệm thức B67 (1,3×104 CFU/mL). Mật độ vi khuẩn tổng có giá trị trung bình ở các nghiệm thức ĐC, B37, B41 và B67 lần lượt là (5,4×104 ± 31,03), (4,1×104 ± 35), (5,3×104 ± 43,19) và (4,2×104 ± 51,1). Qua Hình 4.5 cho thấy mật độ vi khuẩn tổng khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê ở chu kỳ 1 và 3. Mật độ vi khuẩn tổng của ĐC khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại ở chu kỳ 4 (p<0,05), điều này cho thấy tác dụng của bổ sung vi khuẩn là tạo một dịng vi khuẩn hữu ích chiếm ưu thế lấn áp được các dịng vi khuẩn khác. Cịn nghiệm thức ĐC khơng bổ sung vi khuẩn, mật số vi khuẩn tổng có khuynh hướng tăng dần, có thể mật độ vi khuẩn trong nghiệm thức ĐC tăng chủ yếu là nhóm vi khuẩn Vibrio và vi khuẩn tạp. Tuy nhiên mật độ vi khuẩn tổng lại có sự biến động khác nhau giữa các chu kỳ thu mẫu ở từng nghiệm thức. Theo Hagiwata (1995), (trích bởi Rombaut, 2001) thì một số vi khuẩn trong hệ thống ni ln trùng có thể được ln trùng sử dụng làm nguồn thức ăn, cho nên mật độ vi khuẩn có sự biến động giữa các chu kỳ thu mẫu.

a a b a b a ab a a c a a d a ab a 0 2 4 6 8 10 12 14 16

Chu kỳ 1 Chu kỳ 2 Chu kỳ 3 Chu kỳ 4

Chu kỳ thu mẫu

1 0 0 0 0 × C F U /m L ĐC B 37 B 41 B 67 a a a a a b b a a c c a a d d a 0 5 10 15 20 25 30

Chu kỳ 1 Chu kỳ 2 Chu kỳ 3 Chu kỳ 4

Chu kỳ thu mẫu

1 0 0 0 × C F U /m L ĐC B 37 B 41 B 67

Hình 4.5 Biến động mật độ vi khuẩn tổng trong thí nghiệm

4.1.2.2 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus

Mật độ vi khuẩn Bacillus ở tất cả các nghiệm thức dao động từ 0,8×103 – 26,7×103 CFU/mL, cao nhất là ở nghiệm thức B37 và có giá trị trung

bình 12,6×103 ± 59,68 CFU/mL, nghiệm thức đối chứng thấp nhất có giá trị trung bình 2,5×103 ± 32,44 CFU/mL. Qua Hình 4.6 cho thấy ở chu kỳ 2 và chu kỳ 3 mật độ vi khuẩn Bacillus ở nghiệm thức ĐC khác biệt có ý nghĩa thống kê với 3 nghiệm thức còn lại (p<0,05). Mật độ vi khuẩn biến động theo từng chu kỳ thu mẫu, ở các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn mật số Bacillus luôn cao hơn nghiệm thức đối chứng, kết quả này cho thấy có sự liên quan đến việc bổ sung vi khuẩn định kỳ, điều này chứng tỏ việc bổ sung vi khuẩn đã giữ được các mật số vi khuẩn cao hơn rất nhiều so với ĐC.

a a a a b b b a c c c a d d d a 0 20 40 60 80 100

Chu kỳ 1 Chu kỳ 2 Chu kỳ 3 Chu kỳ 4

Chu kỳ thu mẫu

1 0 0 × C F U /m L ĐC B 37 B 41 B 67

4.1.2.3 Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio

Qua cả 4 chu kỳ thu mẫu thì mật độ Vibrio trong các nghiệm thức có bổ sung vi

khuẩn dao động từ 0,68×102 – 19,5×102 CFU/mL, cịn ở nghiệm thức đối chứng dao động từ 1,7×103 – 9,5×103 CFU/mL. Qua Hình 4.7 cho thấy ở các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn thì mật độ Vibrio có xu hướng giảm dần về cuối thí

nghiệm, và khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nghiệm thức ĐC và các nghiệm thức còn lại ở 3 chu kỳ cuối (p<0,05), có thể là do việc bổ sung vi khuẩn Bacillus định kỳ đã làm hạn chế sự phát triển của Vibrio, trong khi ở nghiệm thức đối

chứng mật số Vibrio luôn dao động và không ổn định. Nguyên nhân là do sự tích lũy từ chất thải và thức ăn dư thừa của luân trùng trong q trình ni làm cho mơi trường nước trở nên xấu đi, đó là điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn Vibrio phát triển. Điều này cho thấy sự có mặt của các dịng vi khuẩn có lợi sẽ làm giảm mật