Asbjørn Gildberg và Even Stenberg, (2000)[11] đã nghiên cứu thu hồi protein trong quá trình sản xuất chitosan chất lượng cao dùng trong mỹ phẩm. Trong quá trình thủy phân, tác giả dùng enzyme thương mại có sẵn (alcalase) và protein thủy phân được thành các acid amin thiết yếu với hàm lượng cao, tuy nhiên chúng không làm ảnh hưởng tới chất lượng chitosan. Hàm lượng protein thu được 68,5% cao hơn so với việc thu hồi theo phương pháp thông thường là 12,8%. Ngoài ra, sau khi ly tâm để thu hồi protein còn thu được một lượng astaxanthin để bổ sung vào thức ăn cho cá hồi.
Nghiên cứu kết hợp 3 loại enzyme Pepsin (P), trypsin (T) và subtilisin (S) để thủy phân protein phục vụ cho mục đích ăn kiêng của Raquel Linhares CARREIRA và cộng sự (2004)[13] . Trong quá trình thủy phân protein bị gián đoạn kích thước bởi HPLC và phương pháp vùng để định lượng chuỗi acid amin và các acid amin tự do. Ảnh hưởng của E: S tỷ lệ, nhiệt độ và độ pH trên mô hình sắc ký đã được đánh giá bởi các phản ứng cô lập của pepsin, trong khi thứ tự thêm enzyme vào và thời gian phản ứng của enzyme được phân tích trong trường hợp của sự liên kết các enzyme. Kết quả cho thấy các
mô hình sắc ký phù hợp nhất là sự kết hợp của ba loại enzim trong các điều kiện sau: S (3 giờ, pH 7,5, E: S 4%) + T (1h, pH 7,5, E: S 3,3%) + P (1h, pH 1,9, E: S 4%), ở 37 ° C.
Y. Xu & C. Gallert & J. Winter (2008)[14] đã nghiên cứu Chitin tinh chế từ vỏ
Penaeus monodon và Crangon crangon bằng cách sử dụng một quá trình có hai giai đoạn lên men kỵ khí để thủy phân potein sau đó khử khoáng thông qua quá trình lên men lactic acid. Kết quả là tại pH = 3,6 canxi cacbonat của vỏ được hòa tan. Sau khi khử protein và khử khoáng, vỏ của Tôm sú và C. crangon, hàm lượng protein đã khử được 5,8% hoặc 6,7%, và hàm lượng canxi khử được là 0,3% hoặc 0,4%, tương ứng. Độ nhớt của chitin từ tôm sú và C. crangon là 45 và 135 mPa s tương ứng, trong khi chitn từ vỏ cua (thực tế cấp) có độ nhớt của 21 mPa s. Qua đó cho thấy chất lượng chitin tinh khiết hơn.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1 Đầu tôm
Nguyên liệu đầu tôm được thu mua tại phân xưởng chế biến, Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17). Yêu cầu nguyên liệu phải tươi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, không lẫn tạp chất. Nguyên liệu sau khi lấy cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt có chứa nước đá và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm và được nhặt sạch tạp chất, ép bằng máy ép thủ công để loại bỏ dịch và cân cho vào túi PE (mỗi túi 1kg), bảo quản đông ở điều kiện nhiệt độ -200C tại tủ đông của phòng thí nghiêm.
Khi tiến hành thí nghiệm thì nguyên liệu được xay nhỏ (100% là đầu tôm , tất cả các mẫu thí nghiệm đều được xay bởi cùng một thiết bị và kích thước mẫu sau khi xay là 0,5 ÷ 0,8 cm) và tiến hành làm thí nghiệm ngay.
2.1.2 Enzyme Pepsin
Enzyme sử dụng trong quá trình thí nghiệm là loại P7000 của hãng Sigma được chiết từ niêm mạc lợn, chế phẩm dạng bột màu nâu sáng, dễ hòa tan trong nước và dễ bị hút ẩm. Sản phẩm sản xuất tuân theo các thông số kỹ thuật của tổ chức FAO, WHO, ủy ban phụ gia thực phẩm (JECFA) và hóa thực phẩm FCC
- pH tối thích: 2 ÷ 4
- Hoạt độ: 800 ÷ 2500 Units/mg protein
- Enzyme Pepsin bị bất hoạt trong 15 phút ở 85oC (1850F) hoặc pH > 4 hoặc chất ức chế pepstatin.
- Nhiệt độ 35-37oC.
2.1.3 Hóa chất
Các loại hóa chất sử dụng cho thí nghiệm đều thuộc loại tinh khiết.
2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Mô tả quy trình:
1. Đầu tôm được bảo quản và vận chuyển về phòng thí nghiệm trong thùng xốp có nước đá nhiệt độ 0 ÷ 50C. Loại bỏ tất cả rác, vỏ tôm, thân tôm lẫn vào trong nguyên liệu.
- Nồng độ HCl - Thời gian khử khoáng - pH của môi trường - Tỉ lệ enzyme/ cơ chất - Thời gian thủy phân Dịch Lọc XĐHL protein Bã Rửa Phơi khô Chitin Đầu tôm Ép, cấp đông Rã đông, Xay Khử protein + khử khoáng
2. Dùng máy ép thủ công để loại bỏ phần dịch.
3. Bã ép được xác định hàm lượng protein, hàm lượng ẩm và hàm lượng khoáng. Phần còn lại cho vào túi PE (1kg/1 túi) cấp đông trong tủ đông bảo quản ở -20oC.
4. Chuẩn bị mẫu: Trước mỗi thí nghiệm lấy một túi mẫu mang đi rã đông khoảng 5-10 phút. Mẫu được xay bằng máy xay kích thước khoảng 0.5-0.8 cm.
- Cân 100g mẫu cho vào bình tam giác 500ml. 5. Khử protein kết hợp khử khoáng:
- Bổ sung axit HCl ở các nồng độ khác nhau và thời gian theo mục đích của từng thí nghiệm. Sau đó bổ sung enzyme Pepsin kết hợp với khử khoáng tiếp theo.
- Mẫu đối chứng là mẫu có điều kiện thủy phân giống như các mẫu thí nghiệm nhưng không bổ sung enzyme pepsin.
- Tiến hành thủy phân ở nhiệt độ 37oC, nhiệt độ được duy trì bằng bể ổn nhiệt.
6. Sau khi kết thúc quá trình thủy phân, lấy mẫu ra dùng rây lọc tách bã và dịch sau khi thủy phân.
+ Phần bã: Rửa sạch mang đi phơi khô để xác định hàm lượng protein, hàm lượng khoáng còn lại trên bã, hiệu suất khử protein, khử khoáng.
+ Phần dịch: Dùng NaOH 10% điều chỉnh lên pH=13, để lắng lấy phần dịch trong kiểm tra hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Biuret.
2.2.2 Xác định thành phần hóa học cơ bản của bã ép, dịch và bã sau khi thủy phân thủy phân
2.2.2.1 Xác định thành phần hóa học cơ bản của bã ép
Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần của bã ép.
Tiến hành:
- Xác định hàm lượng protein tổng số: Cân khoảng 1-2g bã đầu tôm cho vào ống vô cơ hóa mẫu của thiết bị chạy Kjeldahl bán tự động để vô cơ hóa mẫu. Sau khi vô cơ hóa mẫu xong tiến hành chưng cất và tính kết quả ta được hàm lượng protein tổng số của bã đầu tôm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và loại các giá trị bất thường và lấy giá trị trung bình.
- Xác định hàm lượng ẩm: Cân khoảng 3-5 g mẫu cho vào cốc sấy đã được sấy tới khối lượng không đổi và được cân ở nhiệt độ 105oC , tới khi khối lượng 2 lần cân không đổi. Sau đó mang cốc sấy đi cân sẽ xác định được hàm lượng ẩm trong bã đầu tôm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và loại các giá trị bất thường và lấy giá trị trung bình.
Đầu tôm Ép Tính kết quả XĐHL protein XĐHL tro XĐHL ẩm Dịch ép Bã ép XĐHL protein hòa tan
- Xác định hàm lượng tro: Cân khoảng 3-5 g mẫu cho vào cốc nung đã được sấy tới khối lượng không đổi và được cân ở nhiệt độ 550oC , tới khi hóa tro trắng. Sau đó mang cốc nung đi cân sẽ xác định được hàm lượng khoáng trong bã đầu tôm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và loại các giá trị bất thường và lấy giá trị trung bình.
2.2.2.2Xác định thành phần hóa học của dịch và bã sau thủy phân.
Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thành phần hóa học của dịch và bã sau thủy phân
Tiến hành:
- Dịch thủy phân: dùng NaOH 10% điều chỉnh pH của dịch lên pH=13, sau đó để lắng và lấy dịch đo bằng phương pháp Biuret.
Ép Bã ép, cấp đông Đầu tôm Rã đông, xay nhỏ Khử protein + khử khoáng Dịch ép Bã ép XĐHL protein XĐHL tro XĐHL ẩm X ĐHL protein hòa tan
- Bã thủy phân: rửa sạch, phơi khô và kiểm tra hàm lượng protein trên bã bằng phương pháp Biuret, kiểm tra hàm lượng ẩm và hàm lượng tro giống như kiểm tra thành phần hóa học của bã sau ép.
2.2.3 Xác định mức độ khử khoáng và pH khi sử dụng axit HCl ở các nồng độ khác nhau.
Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định mức độ khử khoáng và pH khi sử dụng HCl ở các nồng độ khác nhau.
Tiến hành: Tính thể tích acid HCl (1%, 2%, 4%) cần để khử hết khoáng có trong 100g mẫu dựa vào hàm lượng khoáng xác định được từ thí nghiệm
Sau 1h, 2h… Bổ sung acid HCl 4% 2% 1% Ép Bã ép, cấp đông Đầu tôm Rã đông, xay nhỏ XĐHL khoáng Xác định thời gian ổn định pH
2.2.2.1. Sau khi bổ sung acid tiến hành lấy mẫu đo pH 1h/1lần và đồng thời kiểm tra hàm lượng khoáng còn lại trên bã.
2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH tới hoạt động của enzmyme
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt động của pepsin
Tiến hành:
- Bố trí thí nghiệm theo sơ đồ ở hình 2.5. Các thông số cố định như sau:
Xác định hàm lượng ẩm Bã, rửa phơi Xđ hàm lượng khoáng rên bã Xđ hàm lượng protein Dịch trung hòa Xđ protein hòa tan 1÷2 2÷3 3÷4 Rã đông, xay nhỏ Ép Bã ép, cấp đông Đầu tôm Bổ sung acid HCl Khử protein bằng Pepsin
+ Nồng độ acid HCl theo kết quả thí nghiệm 2.2.3 + Thời gian khử khoáng: theo kết quả thí nghiệm 2.2.3
+ Tỉ lệ enzyme pepsin: chọn tỉ lệ 200UI/ kg protein + Thời gian khử protein: chọn thời gian 6h
2.2.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme
Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ enzyme thủy phân Khử khoáng + khử protein Dịch XĐHL protein XĐHL protein XĐHL ẩm Bã XĐHL tro Lọc Ép Bã ép, cấp đông Đầu tôm Rã đông, xay Bổ sung enzyme 500UI 100UI 0UI 200UI Bổ sung acid HCl
Tiến hành:
-Bố trí thí nghiệm theo sơ đồ ở hình 2.6. Các thông số cố định như sau:
+ Nồng độ acid theo kết quả thí nghiệm 2.2.3
+ Tỉ lệ acid theo kết quả thí nghiệm 2.2.3 + pH theo kết quả thí nghiệm 2.2.4
+Thời gian thủy phân chọn thời gian 6h
- Nồng độ enzyme pepsin: 100UI/kg protein, 200 UIkg protein, 500UI/kg protein.
2.2.6 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân
Hình 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân Dịch XĐHL protein XĐHL protein XĐHL ẩm Bã XĐHL tro Lọc Đầu tôm Ép Bã ép, cấp đông Rã đông, xay nhỏ Khử protein + khử khoáng 12h 3h 0h 6h Bổ sung acid HCl
Tiến hành:
- Bố trí thí nghiệm theo sơ đồ ở hình 2.7. Các thông số được cố định như sau:
+ Nồng độ acid HCl theo kết quả thí nghiệm 2.2.3 + thời gian bổ sung acid theo kết quả thí nghiệm 2.2.3 + pH theo kết quả thí nghiệm 2.2.4
+ Tỉ lệ enzyme pepsin theo kết quả thí nghiệm 2.2.5 -Thời gian kể từ khi bổ sung enzyme: 0h, 3h, 6h, 12h.
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 2.3.1Phương pháp nghiên cứu 2.3.1Phương pháp nghiên cứu
- Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Kjeldahl theo TCVN 3705-1990. Hàm lượng protein tổng số = hàm lượng nito tổng số*6,25.
- Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung ở 550oC. - Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp nung ở 1050C.
- Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Biuret với đường chuẩn có phương trình là:
y = 0,051x-0,0095, R2= 0,9964 Trong đó: x là hàm lượng (mg/ml) y là giá trị OD570
- Xác định hàm lượng protein còn lại trên bã bằng phương pháp Biuret. - Hiệu suất khử protein (DP (%)) và khử khoáng (DA (%)) được xác định dựa trên công thức của Rao và cộng sự (2000).
DP (%) = [(P0*O)-(PR*R)]*100/(P0*O) DA (%) = [(A0*O)-(AR*R)]*100/(A0*O) Trong đó:
- A0, AR: Hàm lượng khoáng (g/g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý
- O, R: Khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau xử lý
2.3.2 Phương pháp xử lí số liệu
Số liệu báo cáo là kết quả của 3 lần phân tích. Kết quả được phân tích thống kê bằng phần mềm Excel, sử dụng phần mềm ANOVA. Giá trị của p < 0.05được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả xác định thành phần hóa học của đầu tôm Thẻ chân trắng đã ép sơ bộ ép sơ bộ
Thành phần hóa học cơ bản của tôm gồm nước, protein, khoáng và chitin. Tùy theo loài mà hàm lượng của các thành phần hóa học khác nhau. Tôm thẻ chân trắng là đối tượng mới được nuôi ở nước ta và bắt đầu được sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất chitin với số lượng lớn. Thành phần hóa học của bã ép từ đầu tôm thẻ chân trắng được xác định ở Bảng 1.1
Bảng 3.1: Thành phần hóa học của bã ép từ đầu tôm Thẻ chân trắng
Độ ẩm (%) Proteina (%) Troa (%)
75.59±1.91 48.67± 0.65 22.85±1.54
a
: Tính theo hàm lượng chất khô
Đầu tôm thẻ chân trắng sau khi ép chứa 25.41±1.91 % chất khô, 48.67± 0.65% protein, 22.85±1.54% khoáng.
Từ kết quả trên cho thấy hàm lượng protein và khoáng trên bã ép từ đầu tôm thẻ chân trắng nhỏ hơn so với hàm lượng protein và khoáng trên đầu tôm thẻ chân trắng khi chưa ép của Nguyễn Thị Thắm (2009)[7] tương ứng protein chiếm (48.67± 0.65% và 49.01%), khoáng chiếm (22.85±1.54% và 25.23%). Như vậy quá trình ép đã tách được một lượng protein và một lượng khoáng. Tuy nhiên hàm lượng protein và khoáng còn lại trên bã còn rất cao. Vì vậy cần phải nghiên cứu để có biện pháp khử protein kết hợp khử khoáng có hiệu quả nhất có thể nâng cao chất lượng của chitin cũng như làm tăng chất lượng dịch thủy phân cho quá trình thu hồi protein.
3.2 Kết quả khảo sát mức độ khử khoáng ở các nồng độ axit HCl khác nhau 8.12 6.89 6.76 6.58 6.52 6.38 9.44 8.28 7.80 0 2 4 6 8 10 12 1 2 3 thời gi an khử khoáng(h) h à m l ư ợn g k h o á n g c ò n l ạ i( % ) HCl 1% HCl 2 % HCl 4 %
Hình 3.1: Kết quả hàm lượng khoáng còn lại trên chitin sau khi bổ sung axit HCl ở các nồng độ khác nhau
84.67 87.00 87.24 87.57 87.69 87.95 82.17 84.37 85.28 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 1 2 3
thời gian khử khoáng(h)
h iệ u s u ấ t k h ử k h o á n g (% ) HCl 1% HCl 2% HCl 4%
Hình 3.2: Hiệu suất khử khoáng ở các nồng độ axit HCl khác nhau
Từ kết quả nghiên cứu ở hình 3.1 và 3.2 cho thấy nồng độ và thời gian xử lí axit HCl có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả tách khoáng từ bã ép tôm thẻ chân trắng. Hàm lượng khoáng còn lại khi xử lý với axit giảm rất nhanh. Tuy nhiên ở mỗi nồng độ axit khác nhau thì mức độ khử khoáng khác nhau. Ở
nồng độ 2% lượng khoáng khử được cao nhất, sau 1h lượng khoáng từ 22.85% giảm xuống còn 6.58% hiệu quả khử khoáng lên tới hơn 87% trong khi đó ở nồng độ 1% lượng khoáng khử được thấp hơn, hàm lượng khoáng trên bã còn lại là 8.12% và nồng độ 4% hàm lượng khoáng còn lại trên bã là cao nhất 9.44%. Khi bổ sung axit HCl 1% với tỉ lệ 1/4 do axit có nồng độ thấp nên tốc độ khử khoáng chậm và có xu thế diễn ra tăng dần nhưng khi bổ sung tăng nồng độ axit lên 2% và 4 % với tỉ lệ 1/2 và 1/1 tương ứng. Nhưng đối với nồng độ axit 4%, tỉ lệ 1/1 lượng axit HCl chưa ngập hết mẫu hoàn toàn, khả năng tiếp xúc của cơ chất và enzyme chưa triệt để cũng làm ảnh hưởng tới tốc độ khử khoáng. Như vậy ta thấy sau 1h axit HCl ở nồng độ 2% khử khoáng được nhiều hơn so với nồng độ 1% và 4%. Qua đây chứng tỏ rằng quá trình