2.2.1. Lập hồ sơ bệnh án di truyền
Những cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh đã được thăm khám lâm sàng, khai thác về tiền sử gia đình, tiền sử bản thân bao gồm: tuổi, nghề nghiệp, các bệnh mãn tính (bệnh đái tháo đường, các bệnh về tuyến giáp…), các bệnh nhiễm trùng (viêm gan siêu vi trùng, các bệnh phụ khoa…), có tiếp xúc với các hóa chất độc, thuốc bảo vệ thực vật, có nghiện rượu, thuốc lá… và tiền sử về sản khoa….
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi để thu hoạch cụm kỳ giữa, phân tích nhiễm sắc thể và lập karyotype.
2.2.2.1. Nuôi cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi theo phương pháp của Hungerford D.A. (1965) [38]. Hungerford D.A. (1965) [38].
Lấy 2ml máu tĩnh mạch cho vào ống li tâm đã được tráng bằng heparin đậy nút cao su kín và vô trùng.
Các bước nuôi cấy phải được thực hiện trong buồng cấy tế bào trong điều kiện vô trùng.
Dùng ống hút nhỏ giọt pipet Pasteur cho từ 6 – 8 giọt máu toàn phần vào túyp nuôi cấy có chứa 6ml môi trường nuôi cấy F10 hoặc F12, 2ml huyết thanh bê và 0,1ml PHA ( phytohemagglutinin). Đậy nắp rồi để túyp nuôi cấy trong tủ ấm 37oC thời gian 72 giờ. Đến giờ thứ 70 bổ sung vào túyp nuôi cấy 1ml dung dịch Colcemid với nồng độ 1µg/1ml để tích lũy nhiều cụm kỳ giữa và thu hoạch tế bào ở giờ thứ 72.
2.2.2.2. Thu hoạch tế bào
- Túyp nuôi cấy được li tâm với tốc độ 800 – 1000 vòng/1 phút thời gian 10 phút. - Loại bỏ dịch phía trên giữ lại phần cặn lắng chứa các tế bào, 30ml dung dịch nhược trương KCl 0,075 M cho vào túyp nuôi cấy và để trong tủ ấm 37oC thời gian khoảng 45 phút để phá vỡ màng tế bào.
- Li tâm, loại bỏ phần dịch phía trên, giữ lại phần cặn chứa nhân tế bào và các cụm NST ở kỳ giữa.
- Làm sạch mẫu vật bằng cách trộn với dung dịch Carnoy (3 methanol : 1 acid acetic ) rồi li tâm loại bỏ dịch nổi ở phía trên (3 lần).
- Lần cuối cùng khi mẫu vật đã sạch, sau khi li tâm loại bỏ dịch ở phía trên, dùng ống hút nhỏ giọt pipet Pasteur hút lấy phần cặn chứa nhân tế bào và các cụm kỳ giữa và dàn tế bào đều lên lam kính sạch đã được để lạnh.
- Để tiêu bản khô tự nhiên rồi tiến hành nhuộm tiêu bản.
2.2.2.3. Phương pháp nhuộm băng theo Seabright M (1971) [66].
- Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm băng G theo phương pháp của Seabright. M (1971).
Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất:
Dụng cụ: 5 cốc thủy tinh loại 100ml để đựng hóa chất và thuốc nhuộm, 2 cốc mỏ thủy tinh loại 500ml đựng nước rửa tiêu bản.
Hóa chất: NaCl 0,15N, Trypsin 1: 250 (Difco) KH2PO4, Na2HPO42H2O, Giemsa.
Cách pha hóa chất:
Dung dịch Trypsin mẹ 5%
Dung dịch Trypsin sử dụng: 1 ml dung dịch Trypsin mẹ 49 ml dung dịch NaCl 0,15N Dung dịch đệm photphat KH2PO4 : 3,56g/1 lít
Na2HPO42H2O: 7,22g/1 lít H2O Dung dịch Giemsa 4%: 2 ml dung dịch Giemsa mẹ
48 ml dung dịch đệm photphat pH 6,8
Các bước tiến hành được thực hiện trong điều kiện ở nhiệt độ phòng thí nghiệm:
Nhúng tiêu bản vào cốc đựng dung dịch NaCl 0,15N thời gian khoảng 25 – 30 giây.
Sau đó tiêu bản được cho vào một cốc khác đựng dung dịch Trypsin 0,1% (Difco 1: 250).
Rửa tiêu bản lặp lại 2 lần trong một cốc đựng dung dịch NaCl 0,15N.
Tiêu bản được nhuộm bằng thuốc nhuộm Giemsa 4% pH = 7, thời gian 10 phút.
Tất cả các tiêu bản sau khi nhuộm xong được rửa trong 2 cốc đựng nước máy hoặc dưới vời nước máy chảy nhẹ. Kiểm tra độ phân vùng dưới kính hiển vi, rồi sau đó để tiêu bản khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
2.2.2.4. Phương pháp phân tích nhiễm sắc thể và lập karyotype: theo tiêu chuẩn ISCN (2005) [68]. chuẩn ISCN (2005) [68].
Phân tích NST được thực hiện dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Mỗi cặp vợ chồng được phân tích NST:
- Với tiêu bản nhuộm băng G, chúng tôi phân tích 20 cụm kỳ giữa bao gồm: đếm số lượng NST, phát hiện những bất thường cấu trúc của NST. Trường hợp thể khảm có thể phân tích 100 cụm kỳ giữa.
- Tiêu chuẩn đánh giá: quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại x1000, tìm các cụm NST của tế bào đang phân chia ở kỳ giữa. Sau đó chọn các cụm có các NST trải đều trên một diện tích và tạo thành một đám tròn tương đối đều đặn, các NST không chồng chất lên nhau có thể phân biệt được từng chiếc và đếm chính xác số lượng NST của từng cụm. Cũng trong các cụm đó, quan sát kỹ từng chiếc NST, phát hiện những bất thường về cấu trúc.
Lập karyotype: Mỗi bệnh nhân được chọn 3 cụm kỳ giữa và lập karyotype trên phần mềm của vi tính theo tiêu chuẩn ISCN – 2005 (An International System for Human Cytogenetic Nomenclature) .
Tổng hợp các số liệu đã quan sát rồi kết luận về số lượng và cấu trúc của bộ NST.
2.2.3. Xử lý số liệu
Các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh được thăm khám và xét nghiệm NST, lập karyorype. Các số liệu được mã hóa nhập vào máy vi tính, xử lý và kiểm tra độ chính xác bằng các phương pháp thống kê Y học. Số liệu được xử lý và phân tích bằng chương trình Microsoft Excel 2007.
Các ứng dụng:
- Các hàm tính toán: SUM, AVERAGE, STDEV, MIN, MAX…. - Vẽ đồ thị và biểu đồ.
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Trong thời gian từ tháng 10 năm 2009 đến tháng 10 năm 2011, tổng số 350 cặp vợ chồng (700 trường hợp) có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh được thăm khám lâm sàng tại bệnh viện Phụ sản Trung Ương, bệnh viện Phụ sản Hà Nội, Khoa sản bệnh viện Bạch Mai…đã gửi đến bộ môn Y sinh học – Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội yêu cầu xét nghiệm NST, phân tích và lập karyotype, chúng tôi thu được kết quả như sau:
3.1. Tuổi của các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh
Tổng số 350 cặp vợ chồng (700 trường hợp) có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh. Trong đó:
- Tuổi của người vợ thấp nhất là 19 tuổi, cao nhất là 40 tuổi, trung bình 28,94 ± 4,3 - Tuổi của người chồng thấp nhất là 23 tuổi, cao nhất là 50 tuổi, trung bình 33 ± 6.
Bảng 1. Sự phân bố theo tuổi của các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh. Tuổi Vợ Chồng Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Số lượng (n) Tỷ lệ (%) ≤ 20 6 1,71 0 0 20 – 30 237 67,72 145 41,43 30 – 40 107 30,57 172 49,14 > 40 0 0 33 9,43 Tổng 350 100 350 100
Trong một số nghiên cứu của các tác giả trước trên thế giới khi phân tích karyotype ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh
như: Simona Farcas và cs khi nghiên cứu vai trò của chuyển đoạn NST trong sảy thai liên tiếp đã phân tích NST của 260 cặp vợ chồng sảy thai từ 2 đến 10 lần trong đó tuổi của người vợ từ 20 – 43 tuổi [64]. Razied Dehghani Firoozabadi M.D và cs phân tích NST của 88 cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp, trong đó người vợ có tuổi từ 18 đến 43, trung bình là 27,4 [61]. Sei Kwang Kim và cs [65] phân tích NST của một cặp vợ chồng, người vợ 29 tuổi và người chồng 31 tuổi. P R Scarbrough và cs [59] đã phát hiện một cặp vợ chồng cả hai đều 25 tuổi, người vợ mang chuyển đoạn tường hỗ t(7p;13q), người chồng mang chuyển đoạn hòa hợp tâm t(13q;14q). Rối loạn NST phức tạp ở người vợ 25 tuổi, karyotype 46,XX,t(7;15;13) (p15;q21;q31), người chồng 28 tuổi có karyotype bình thường 46,XY được PriyaA.Iyer [60] phát hiện.
Khi nghiên cứu về đặc điểm karyotype ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh. Nguyễn Văn Rực [6] đã phân tích NST ở người vợ có tuổi thấp nhất là 23, cao nhất là 39 và trung bình là 29,79 ± 2,6; tuổi của người chồng thấp nhất là 25, cao nhất là 50 và trung bình là 33,36 ± 4,2. Nhìn chung theo thống kê của nhiều tác giả trên thế giới và Việt Nam thì độ tuổi của các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh đều nằm trong độ tuổi sinh sản.
Stephenson MD và cs (2002) khi phân tích các thai sảy đã có nhận xét rằng nguyên nhân chính của sảy thai là do yếu tố di truyền. Tỷ lệ rối loạn NST theo thứ tự là trisomi NST thường, đa bội và monosomi NST X. Phần lớn thai trisomi có liên quan đến tuổi của người mẹ, và sảy thai tự nhiên ít liên quan đến người mẹ trẻ tuổi hơn so với người mẹ > 36 tuổi có tiền sử sảy thai liên tiếp [67].
Những cặp vợ chồng trong nghiên cứu của chúng tôi nhóm chiếm tỷ lệ cao nhất ở người vợ là 20 - 30 tuổi có 237 trường hợp chiếm 67,72%, ở người chồng là 30 - 40 tuổi có 172 trường hợp chiếm 49,14%. Nhóm chiếm tỷ lệ cũng tương đối cao ở người vợ là từ 30 - 40 tuổi có 107 trường hợp chiếm 30,57%, ở người chồng là nhóm 20 - 30 tuổi có 145 trường hợp chiếm 41,43%. Hai nhóm chiếm tỷ lệ thấp
là ≤ 20 tuổi và > 40 tuổi. Nhìn chung các bệnh nhân trong nghiên cứu này phần lớn nằm trong độ tuổi mà khả năng sinh sản là cao nhất.
Theo chúng tôi kết quả ở bảng 1 là hoàn toàn hợp lý, bởi lẽ ở Việt Nam độ tuổi của nữ từ 20-30 là độ tuổi xây dựng gia đình phổ biến nhất hiện nay. Hơn nữa bình thường một cặp vợ chồng ở độ tuổi này sau khi xây dựng gia đình thường muốn có con ngay nên sau một, hai lần sảy thai hay sinh con bị dị tật bẩm sinh họ đã đi khám và được chỉ định xét nghiệm NST, do đó các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh thường phát hiện được ở nhóm tuổi này. Nhóm tuổi 30 – 40 ở người chồng chiếm tỷ lệ cao, theo chúng tôi, ngày nay xu hướng càng nhiều người xây dựng gia đình muộn nhất là ở khu vực thành thị và thường sau một vài lần bị sảy thai hay sinh con bị dị tật họ mới đi khám và được chỉ định xét nghiệm NST.
3.2. Nghề nghiệp của các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh
Trong tổng số 350 cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh đã được xét nghiệm, phân tích NST và lập karyotype bao gồm: cán bộ viên chức (CBVC), công nhân, làm ruộng, bộ đội, lao động tự do. Sự phân bố về nghề nghiệp của các cặp vợ chồng được trình bày ở bảng 2.
Nguyễn Văn Rực phân tích đặc điểm karyotype của những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh trong đó ở người vợ nhóm cán bộ công chức chiếm 63,77%, nhóm làm ruộng chiếm 26,09% và nhóm làm các nghề khác chiếm 10,14%, ở người chồng nhóm cán bộ công chức chiếm 60,87%, nhóm làm ruộng 14,49%, bộ đội chiếm 7,25%, nhóm làm các nghề khác chiếm 17,39% [6].
Bảng 2. Sự phân bố về nghề nghiệp ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh.
Nghề nghiệp Vợ Chồng Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Số lượng (n) Tỷ lệ (%) CBVC 138 39,43 126 36 Công nhân 38 10,86 53 15,14 Làm ruộng 29 8,29 26 7,43 Bộ đội 4 1,14 16 4,57 Tự do 141 40,29 129 36,86 Tổng 350 100 350 100
Trong nghiên cứu này, các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh được xét nghiệm, phân tích NST bao gồm phần lớn là nghề tự do: người vợ là 141 trường hợp (chiếm 40,29%), người chồng là 129 trường hợp (chiếm 36,86%), nhóm cán bộ viên chức, làm nghề có tính chất văn phòng người vợ có 138 trường hợp (chiếm 39,43%), người chồng có 126 trường hợp (chiếm 36%). Điều này là do các đối tượng sống chủ yếu ở Hà Nội và các tỉnh gần Hà Nội thuận tiện về thông tin, phương tiện đi lại vv… nên đi khám và làm xét nghiệm. Các nhóm đối tượng khác chiếm tỷ lệ thấp hơn như: công nhân người vợ có 38 (chiếm 10,86%), người chồng có 53 (chiếm 15,14%), nhóm làm ruộng người vợ có 29 (chiếm 8,29%), nhóm đối tượng bộ đội người vợ có 4 (chiếm 1,14%), người chồng có 16 (chiếm 4,57%).
Nhìn chung các tác giả trong nước và thế giới khi phân tích về các yếu tố nguy cơ trong các trường hợp sảy thai liên tiếp đã có nhận xét rằng: những cặp vợ chồng do nghề nghiệp phải tiếp xúc với các chất đồng vị phóng xạ, các loại hóa
chất, các kim loại nặng như chì, thủy ngân, các dung môi hữu cơ…thì tỷ lệ thai sảy có bất thường về NST cao so với những cặp vợ chồng không bị nhiễm [11,67,72].
Các cặp vợ chồng trong nghiên cứu của chúng tôi thuộc các nhóm nghề khác nhau nhưng nhìn chung đều không phải tiếp xúc với các chất đồng vị phóng xạ, các loại hóa chất độc hại, các thuốc bảo vệ thực vật. Những bệnh nhân này đã được chỉ định xét nghiệm di truyền để xác định xem họ có bị rối loạn ở mức độ NST hay không, mà những bất thường này có thể là nguyên nhân gây sảy thai sớm và sinh con bị dị tật.
3.3. Biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh sinh con bị dị tật bẩm sinh
Trong số 350 cặp vợ chồng (700 trường hợp) có tiền sử sảy thai liên tiếp hoặc sảy thai và sinh con bị dị tật bẩm sinh được xét nghiệm NST, phân tích và lập karyotype chúng tôi đã phát hiện có 24 cặp vợ chồng ở 1 trong 2 người (người vợ hoặc người chồng) mang rối loạn NST (chiếm tỷ lệ 6,86%), 326 cặp vợ chồng (chiếm tỷ lệ 93,14%) có karyotype bình thường (46,XX hoặc 46,XY).
Hình 4.Tỷ lệ rối loạn NST ở những cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh.
Khi nghiên cứu vai trò của rối loạn NST đến sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật một số tác giả đã nhật xét rằng: rối loạn NST sẽ dẫn đến làm giảm khả năng
sinh sản ở cả nam giới và nữ giới. Bố mẹ mang rối loạn NST sẽ có nguy cơ cao sinh ra những đứa trẻ dị tật. Rối loạn NST được công nhận là nguyên nhân chính dẫn đến sảy thai sớm. Ở các cặp bố mẹ có tiền sử sảy thai liên tiếp có khả năng mang rối loạn NST cao hơn so với các cặp bố mẹ bình thường. [17,35,49,50,56,69]. Khoảng 7% các cặp vợ chồng sảy thai tự nhiên ít nhất 2 lần, có 1 trong 2 bố mẹ mang rối loạn NST cân bằng. Nếu bố hoặc mẹ mang rối loạn NST cân bằng thì NST khó có thể ghép cặp và phân ly trong suốt quá trình giảm phân hình thành giao tử. Kết quả là giao tử sẽ mang NST rối loạn vì vậy khi thụ tinh sẽ tạo ra hợp tử có bộ NST không cân bằng. Sự rối loạn NST này sẽ làm chết phôi hoặc bào thai đang phát triển đây là lý do dẫn đến hiện tượng sảy thai tự nhiên liên tiếp. Tuy nhiên một vài trường hợp bào thai tiếp tục phát triển cho đến khi sinh thì sẽ sinh ra đứa trẻ mang nhiều dị tật bẩm sinh hoặc chậm phát triển trí tuệ [64].
Theo Griebel CP. và cs [35], Blohm F và cs [17] cho biết có ít nhất 5% các cặp vợ chồng sảy thai tự nhiên được xét nghiệm có biểu hiện rối loạn NST, các tác giả cũng cho biết rối loạn NST là lý do của sảy thai tự nhiên.
Mặc dù đã có nhiều tác giả nghiên cứu về bất thường NST ở các cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh. Tuy nhiên kết quả nghiên cứu của các tác giả cũng khác nhau. Dưới đây, chúng tôi xin trình bày thống kê kết quả