2.5.1 Lịch sử phát hiện và phân loại
Chi Methylobacterium bao gồm nhiều loài vi khuẩn có sắc tố hồng dinh
dƣỡng methyl tùy ý (pink- pigmented facultative methlotrophs, PPFM) [24], [53]. Chúng có khả năng sử dụng các hợp chất chỉ chứa một nguyên tử carbon nhƣ formaldehyde, methanol hay các hợp chất chứa nhiều nguyên tử carbon làm nguồn cung cấp năng lƣợng và carbon cho quá trình sinh trƣởng [44]. Đa số các loài đều có khả năng phát triển trên môi trƣờng nutrient agar, một số loài có khả năng tăng trƣởng trên môi trƣờng có bổ sung methylamine và chỉ có một loài có khả năng sử dụng methan [34].
Loài Methylobacterium đƣợc phân lập và mô tả lần đầu tiên vào năm 1913
khuẩn PPFM hiện diện rất phổ biến trong đất hay trên các sinh vật nhƣng trong một thời gian dài các vi khuẩn này không đƣợc phân lập và nghiên cứu nhiều. Vào những năm 1960, 1970 khi nghiên cứu tập trung vào con đƣờng đồng hóa các hợp chất một cacbon thì nhóm vi khuẩn dinh dƣỡng methyl đƣợc phân lập và nghiên cứu, trong đó tập trung vào các phƣơng thức biến dƣỡng năng lƣợng và những ứng dụng của nhóm vi khuẩn này [34].
Năm 1974, Patt và các cộng sự phân lập đƣợc loài vi khuẩn PPFM đầu tiên có khả năng sử dụng methan. Loài này sắp xếp vào một chi mới là
Methylobacterium với tên loài là Methylobacterium organophilum. Năm 1982,
Green và Bousfield nhận thấy chủng Methylobacterium organophilum có nhiều
đặc điểm rất giống các loài vi khuẩn PPFM đã đƣợc công bố trƣớc đây. Khi so sánh 140 đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái của 149 chủng vi khuẩn PPFM với lòai M. organophilum cho thấy chúng tƣơng đồng hơn 70%. Do vậy, Green và Bousfield đã đề nghị sắp xếp các loài vi khuẩn PPFM vào chi Methylobacterium
[34].
Từ năm 1992 đến năm 2005 đã có thêm 15 loài Methylobacterium sp. mới phân lập và đặt tên. Trong đó, các loài mới đƣợc xác định nhờ vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác biệt và sự tƣơng đồng của trình tự rRNA giữa các loài khác nhau [29], [48], [62]. Vị trí phân loại chi Mehtylobacterium trong giới vi sinh vật nhƣ sau: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacterium Lớp: Alphaproteobacteria Bộ: Rhizobiales Họ: Methylobacteriaceae
2.5.2 Đặc điểm sinh thái
Vi khuẩn Methylobacterium phân bố rộng rãi trong tự nhiên, chúng hiện
diện trong nhiều môi trƣờng khác nhau bao gồm: đất, đất bùn ao hồ, nƣớc sạch, nƣớc mƣa, không khí, bề mặt lá cây, nốt sần ở rễ thực vật, các loại hạt giống…[23], [29].
PPFM phân bố rộng rãi trên nhiều loài cây, chúng đƣợc phân lập từ hơn 100 loài thực vật từ địa tiền, rêu cho đến các loài cây hạt trần và cây hạt kín [26]. Vi khuẩn PPFM là những vi khuẩn hiếu khí hoàn toàn, do vậy các vi khuẩn này thƣờng đƣợc phân lập từ bất kỳ môi trƣờng nƣớc sạch nào có chứa oxy hòa tan. Ngoài ra, vi khuẩn PPFM còn có khả năng kháng với ion Cl- nên chúng vẫn hiện diện trong nƣớc sạch dùng trong sinh hoạt [32], [33]. Vi khuẩn PPFM thƣờng lan truyền qua không khí và có khả năng thực hiện nhiều quá trình trao đổi chất khác nhau, trong một số điều kiện thuận lợi nhất định vi khuẩn PPFM có khả năng lên men tạo ra các sản phẩm khác nhau. Do vậy, các vi khuẩn PPFM đang đƣợc sử dụng các sản phẩm có giá trị sinh học, chẳng hạn nhƣ các hợp chất polyme sinh học [27], [34].
Hình 2.3: Methylobacterium sp. trên cây rêu (A), hình dạng tế bào vi khuẩn
2.5.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá
Hầu hết các loài vi khuẩn Methylobacterium sp. thƣờng có hình que (0,8-1,0 x 1,0-0,8 μM). Vi khuẩn thƣờng nằm ở dạng tế bào đơn hay đôi hay đôi khi kết lại theo dạng hoa hồng (rosettes) [9].
Hình 2.4: Methylobacterium sp. chủng BJ001 nuôi cấy trên môi trƣờng thạch LB (A) vào môi trƣờng dịch thể LB (B) chụp qua kính hiển vi điện tử quét [22]
Đa số các chủng đều có khả năng di động nhờ một tiêm mao ở cực hay gần cực, tuy nhiên một vài loài lại không có khả năng di động. Đa số các loài vi khuẩn
Methylobacterium sp. là vi khuẩn Gram âm, một số có Gram biến đổi. Vi khuẩn
thƣờng tăng trƣởng chậm, khuẩn lạc thƣờng có màu hồng đậm hay đỏ cam sáng, một số chủng không tăng trƣởng đƣợc trên môi trƣờng nutrient agar. Sắc tố hồng của vi khuẩn không tan trong nƣớc, không phát sáng huỳnh quang và là hợp chất carotenoid, hấp thu bƣớc sóng cực đại ở 473, 499 và 532 nm [29], [34].
Ở môi trƣờng lỏng nuôi cấy tĩnh vi khuẩn tạo thành một lớp màng mỏng trên bề mặt, điều này cho thấy hầu hết các chủng là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Oxidase dƣơng tính yếu, catalase dƣơng tính hay âm tính tuỳ thuộc vào loài vi khuẩn. Methylobacterium sp. là những vi khuẩn hoá dị dƣỡng, có khả năng sử
dụng tùy ý các hợp chất methyl. Do vậy, tất cả các loài đều có khả năng tăng trƣởng trên môi trƣờng có bổ sung formaldehyde (ở nồng độ thấp), formate và methanol, một vài loài có khả năng sử dụng các hợp chất methylamine, chỉ có một
loài duy nhất là M. organophilum có khả năng sử dụng methane làm nguồn cung
cấp carbon và năng lƣợng [29], [34].
Nhiệt độ thích hợp dao động từ 25 đến 30oC, một số loài vẫn có thể sinh trƣởng ở nhiệt độ 37o
C hay 51oC. Đa số các loài đều tăng trƣởng ở pH trung tính, một số loài phát triển ở pH=4, pH=10.
Hầu hết các loài đều nhạy cảm với các hợp chất kháng sinh nhƣ: kanamycin, gentamycin, streptomycin và tetracylin, trong đó chất kháng sinh tetracylin có hoạt tính ức chế mạnh đối với vi khuẩn Methylobacterium sp. [34].
2.5.4 Các ứng dụng của vi khuẩn Methylobacterium sp. 2.5.4.1 Tƣơng tác với thực vật 2.5.4.1 Tƣơng tác với thực vật (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Giữa cây và vi khuẩn có quan hệ tƣơng hỗ, một số vi khuẩn có lợi cho cây trồng vì chúng tham gia vào các chu trình sinh địa hoá, cung cấp cho cây các chất dinh dƣỡng cần thiết. Vi khuẩn dinh dƣỡng methyl chiếm tỷ lệ lớn trong hệ vi sinh vùng lá của nhiều loài cây. Kalyaeva và cộng sự (2000, 2003) phát hiện việc gây nhiễm vi khuẩn Methylovorus mays và Methylomonas methanica vào môi trƣờng
nuôi cấy invitro tạo mối liên kết bền vững giữa vi khuẩn và mô thực vật [39], [40]. Thuốc lá, cây lanh và khoai tây khi nhiễm vi khuẩn tăng trƣởng mạnh hơn so với đối chứng (số chồi tăng, rễ phát triển mạnh), ngay cả trên môi trƣờng không có vitamine [35].
Hình 2.5: Sự tái sinh chồi của loài cây thuốc lá chuyển gen ipt trên môi trƣờng MS không bổ sung hormone sau một tháng nuôi cấy. (a): không bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays. (b): có bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays [39] Theo Maliti (2000), so với các vi khuẩn liên kết với thực vật khác thì vi khuẩn Methylobacterium sp. là loài tồn tại lâu dài và chiếm tỉ lệ lớn nhất khi bề mặt lá đƣợc rửa sạch [46]. Holland và cộng sự (1994) đã đề cập đến việc khử trùng thông thƣờng trong khâu chuẩn bị nuôi cấy mô không loại trừ đƣợc
Methylobacterium sp., dù đã xử lý với hypochlorite và cồn nhƣng các mô sẹo phát
sinh từ mẫu cấy này vẫn có nguy cơ bị nhiễm PPFM [35]. Đây là nhóm vi khuẩn rất phong phú và không gây bệnh thực vật. PPFM chiếm tỷ lệ lớn và có mật độ từ 104 đến 107 đơn vị khuẩn lạc (cfu) trên mỗi gram trọng lƣợng tƣơi của mô thực vật [35]. Chúng lây nhiễm qua hạt [26], ở hạt đậu nành khô mật độ là 105 cfu/gram [35].
Tuy PPFM không tăng trƣởng nhanh nhƣ các vi khuẩn vùng lá khác trên môi trƣờng giàu dinh dƣỡng nhƣng chúng vẫn có khả năng cạnh tranh tạo khuẩn lạc trên lá. Một số tác giả cho rằng dinh dƣỡng methyl tuỳ ý ở PPFM là một phần lý do duy trì mối quan hệ giữa chúng với thực vật. Bằng cách sử dụng nguồn thức ăn khác thƣờng là methanol, PPFM có thể loại bỏ chất độc này khỏi mô thực vật