Ánh sáng: Nhu cầu ánh sáng cho sự hình thành và tăng trƣởng của mô sẹo tuỳ thuộc vào loài thực vật. Ở một số loài, mô sẹo thƣờng đƣợc cảm ứng và tăng trƣởng trong điều kiện tối tuy nhiên một số loài sự cảm ứng và tăng trƣởng của mô
sẹo đòi hỏi điều kiện ánh sáng hoặc quang kỳ thích hợp [55]. Hiệu ứng ánh sáng với chiều hƣớng tăng trƣởng và biệt hóa tế bào trong nuối cấy
tế bào in vitro không chỉ phụ thuộc vào kiểu gen của vật liệu nuôi cấy mà còn phụ thuộc vào bƣớc sóng, cƣờng độ, thời gian chiếu sáng và giai đoạn tăng trƣởng của tế bào nuôi cấy [33].
Nhiệt độ: Hầu hết các mô và tế bào đều tăng trƣởng tốt ở điều kiện nhiệt độ khoảng 26-30o
C [43]. Tuy nhiên, hiệu ứng nhiệt độ cũng thay đổi tùy loài thực vật
2.3.3.3 Ảnh hƣởng của chất điều hoà tăng trƣởng thực vật
Chất điều hòa tăng trưởng thực vật là thuật ngữ đƣợc dùng để chỉ tổng quát những hợp chất hữu cơ có tác động làm biến đổi một quá trình sinh lý nào đó của thực vật ở nồng độ rất thấp. Chúng không phải là chất dinh dƣỡng hay là nguyên tố khoáng cần thiết cho sự tăng trƣởng của thực vật [11].
Kích thích tố thực vật (phytohormone) là thuật ngữ đƣợc dùng để chỉ những hợp chất thiên nhiên do thực vật tạo ra với hàm lƣợng rất thấp từ vị trí sản xuất di chuyển đến vị trí hoạt động: ở đây, chúng tác động làm biến đổi một quá trình sinh lý nào đó của thực vật [11].
Để có hoạt tính, các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật phải cố định trên một thể nhận chuyên biệt của tế bào đích, thể nhận này có thể thay đổi theo mô đích, nên một chất điều hòa tăng trƣởng thực vật có hiệu ứng khác nhau trên những mô đích khác nhau. Nhìn chung, hoạt động của các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật phụ thuộc vào các yếu tố sau:
- Bản chất và nồng độ của các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật.
- Sự cân bằng giữa các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật trong mô đích. - Loại mô đích và trạng thái sinh lý của mô đích [3]
2.4. Ảnh hƣởng của vi sinh vật lên sự phát triển của thực vật
Giữa thực vật và vi sinh vật có mối quan hệ mật thiết với nhau, bên cạnh một số vi sinh vật có hại thì một số khác có lợi cho cây trồng giúp cây dễ hấp thu, có khả năng tổng hợp các hormone tăng trƣởng thực vật và các chất tạo tính kháng với các tác nhân gây bệnh. Dựa vào những đặc điểm có lợi đó ngƣời ta áp dụng các kỹ thuật sinh học tạo ra các loại phân bón, thuốc trừ sâu sinh học thay thế cho phân bón, thuốc trừ sâu hóa học gây độc cho ngƣời và động vật. Ví dụ nhƣ:
- Azobacterin là loại vi khuẩn cố định đạm, có khả năng cung cấp một lƣợng lớn chất auxin, giberelin do đó để tăng năng suất cây trồng trong đó có cây lúa, ngƣời ta sản xuất hàng loạt các vi khuẩn này để sản xuất phân bón cho đất màu mỡ gọi là phân sinh học Azotobacterin [4].
- Nấm Trichoderma là nấm hiện diện trên nhiều thực vật và là chủng nấm có lợi, khi xử lý trên ruộng lúa thì không những gia tăng năng suất lúa mà còn gia tăng khả năng kháng bệnh của cây lúa [10].
- Baculovirus gây nhiễm cho hơn 600 loài côn trùng khác nhau, vấn đề quan trọng là nó không gây nhiễm cho ngƣời, động vật và cả thực vật. Baculovirus có tiềm năng nhƣ là tác nhân kiểm soát sinh học đối với vật làm hại côn trùng. Song thị trƣờng áp dụng còn nhiều hạn chế, do đó đòi hỏi phải có nhiều hiểu biết hơn nữa để kiểm soát sự biểu hiện gene của Baculovirus hy vọng mang đến nhiều lợi ích cho sản xuất vaccin và thuốc trừ sâu sinh học [4].
* Trong nuôi cấy mô tế bào, điều kiện vô trùng phải đƣợc đảm bảo tuyệt đối,
và chíng điều kiện vô trùng đã loại bỏ các mối tƣơng tác có ích giữa thực vật và vi sinh vật. Có rất nhiều nghiên cứu đã đƣợc tiến hành nhằm mục tiêu chọn lọc những chủng vi khuẩn có tác động tốt tới sự phát triển của cây in vitro, cải thiện
phẩm chất, phát triển khả năng trong chọn lọc giống cây trồng. Một vài nghiên cứu gần đây đã đề cập đến tác động của vi khuẩn Methylobacterrium sp. lên nhiều loại cây trồng.
2.5. Đặc điểm của chi Methylobacterium 2.5.1 Lịch sử phát hiện và phân loại 2.5.1 Lịch sử phát hiện và phân loại
Chi Methylobacterium bao gồm nhiều loài vi khuẩn có sắc tố hồng dinh
dƣỡng methyl tùy ý (pink- pigmented facultative methlotrophs, PPFM) [24], [53]. Chúng có khả năng sử dụng các hợp chất chỉ chứa một nguyên tử carbon nhƣ formaldehyde, methanol hay các hợp chất chứa nhiều nguyên tử carbon làm nguồn cung cấp năng lƣợng và carbon cho quá trình sinh trƣởng [44]. Đa số các loài đều có khả năng phát triển trên môi trƣờng nutrient agar, một số loài có khả năng tăng trƣởng trên môi trƣờng có bổ sung methylamine và chỉ có một loài có khả năng sử dụng methan [34].
Loài Methylobacterium đƣợc phân lập và mô tả lần đầu tiên vào năm 1913
khuẩn PPFM hiện diện rất phổ biến trong đất hay trên các sinh vật nhƣng trong một thời gian dài các vi khuẩn này không đƣợc phân lập và nghiên cứu nhiều. Vào những năm 1960, 1970 khi nghiên cứu tập trung vào con đƣờng đồng hóa các hợp chất một cacbon thì nhóm vi khuẩn dinh dƣỡng methyl đƣợc phân lập và nghiên cứu, trong đó tập trung vào các phƣơng thức biến dƣỡng năng lƣợng và những ứng dụng của nhóm vi khuẩn này [34].
Năm 1974, Patt và các cộng sự phân lập đƣợc loài vi khuẩn PPFM đầu tiên có khả năng sử dụng methan. Loài này sắp xếp vào một chi mới là
Methylobacterium với tên loài là Methylobacterium organophilum. Năm 1982,
Green và Bousfield nhận thấy chủng Methylobacterium organophilum có nhiều
đặc điểm rất giống các loài vi khuẩn PPFM đã đƣợc công bố trƣớc đây. Khi so sánh 140 đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái của 149 chủng vi khuẩn PPFM với lòai M. organophilum cho thấy chúng tƣơng đồng hơn 70%. Do vậy, Green và Bousfield đã đề nghị sắp xếp các loài vi khuẩn PPFM vào chi Methylobacterium
[34].
Từ năm 1992 đến năm 2005 đã có thêm 15 loài Methylobacterium sp. mới phân lập và đặt tên. Trong đó, các loài mới đƣợc xác định nhờ vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác biệt và sự tƣơng đồng của trình tự rRNA giữa các loài khác nhau [29], [48], [62]. Vị trí phân loại chi Mehtylobacterium trong giới vi sinh vật nhƣ sau: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacterium Lớp: Alphaproteobacteria Bộ: Rhizobiales Họ: Methylobacteriaceae
2.5.2 Đặc điểm sinh thái
Vi khuẩn Methylobacterium phân bố rộng rãi trong tự nhiên, chúng hiện
diện trong nhiều môi trƣờng khác nhau bao gồm: đất, đất bùn ao hồ, nƣớc sạch, nƣớc mƣa, không khí, bề mặt lá cây, nốt sần ở rễ thực vật, các loại hạt giống…[23], [29].
PPFM phân bố rộng rãi trên nhiều loài cây, chúng đƣợc phân lập từ hơn 100 loài thực vật từ địa tiền, rêu cho đến các loài cây hạt trần và cây hạt kín [26]. Vi khuẩn PPFM là những vi khuẩn hiếu khí hoàn toàn, do vậy các vi khuẩn này thƣờng đƣợc phân lập từ bất kỳ môi trƣờng nƣớc sạch nào có chứa oxy hòa tan. Ngoài ra, vi khuẩn PPFM còn có khả năng kháng với ion Cl- nên chúng vẫn hiện diện trong nƣớc sạch dùng trong sinh hoạt [32], [33]. Vi khuẩn PPFM thƣờng lan truyền qua không khí và có khả năng thực hiện nhiều quá trình trao đổi chất khác nhau, trong một số điều kiện thuận lợi nhất định vi khuẩn PPFM có khả năng lên men tạo ra các sản phẩm khác nhau. Do vậy, các vi khuẩn PPFM đang đƣợc sử dụng các sản phẩm có giá trị sinh học, chẳng hạn nhƣ các hợp chất polyme sinh học [27], [34].
Hình 2.3: Methylobacterium sp. trên cây rêu (A), hình dạng tế bào vi khuẩn
2.5.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá
Hầu hết các loài vi khuẩn Methylobacterium sp. thƣờng có hình que (0,8-1,0 x 1,0-0,8 μM). Vi khuẩn thƣờng nằm ở dạng tế bào đơn hay đôi hay đôi khi kết lại theo dạng hoa hồng (rosettes) [9].
Hình 2.4: Methylobacterium sp. chủng BJ001 nuôi cấy trên môi trƣờng thạch LB (A) vào môi trƣờng dịch thể LB (B) chụp qua kính hiển vi điện tử quét [22]
Đa số các chủng đều có khả năng di động nhờ một tiêm mao ở cực hay gần cực, tuy nhiên một vài loài lại không có khả năng di động. Đa số các loài vi khuẩn
Methylobacterium sp. là vi khuẩn Gram âm, một số có Gram biến đổi. Vi khuẩn
thƣờng tăng trƣởng chậm, khuẩn lạc thƣờng có màu hồng đậm hay đỏ cam sáng, một số chủng không tăng trƣởng đƣợc trên môi trƣờng nutrient agar. Sắc tố hồng của vi khuẩn không tan trong nƣớc, không phát sáng huỳnh quang và là hợp chất carotenoid, hấp thu bƣớc sóng cực đại ở 473, 499 và 532 nm [29], [34].
Ở môi trƣờng lỏng nuôi cấy tĩnh vi khuẩn tạo thành một lớp màng mỏng trên bề mặt, điều này cho thấy hầu hết các chủng là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Oxidase dƣơng tính yếu, catalase dƣơng tính hay âm tính tuỳ thuộc vào loài vi khuẩn. Methylobacterium sp. là những vi khuẩn hoá dị dƣỡng, có khả năng sử
dụng tùy ý các hợp chất methyl. Do vậy, tất cả các loài đều có khả năng tăng trƣởng trên môi trƣờng có bổ sung formaldehyde (ở nồng độ thấp), formate và methanol, một vài loài có khả năng sử dụng các hợp chất methylamine, chỉ có một
loài duy nhất là M. organophilum có khả năng sử dụng methane làm nguồn cung
cấp carbon và năng lƣợng [29], [34].
Nhiệt độ thích hợp dao động từ 25 đến 30oC, một số loài vẫn có thể sinh trƣởng ở nhiệt độ 37o
C hay 51oC. Đa số các loài đều tăng trƣởng ở pH trung tính, một số loài phát triển ở pH=4, pH=10.
Hầu hết các loài đều nhạy cảm với các hợp chất kháng sinh nhƣ: kanamycin, gentamycin, streptomycin và tetracylin, trong đó chất kháng sinh tetracylin có hoạt tính ức chế mạnh đối với vi khuẩn Methylobacterium sp. [34].
2.5.4 Các ứng dụng của vi khuẩn Methylobacterium sp. 2.5.4.1 Tƣơng tác với thực vật 2.5.4.1 Tƣơng tác với thực vật
Giữa cây và vi khuẩn có quan hệ tƣơng hỗ, một số vi khuẩn có lợi cho cây trồng vì chúng tham gia vào các chu trình sinh địa hoá, cung cấp cho cây các chất dinh dƣỡng cần thiết. Vi khuẩn dinh dƣỡng methyl chiếm tỷ lệ lớn trong hệ vi sinh vùng lá của nhiều loài cây. Kalyaeva và cộng sự (2000, 2003) phát hiện việc gây nhiễm vi khuẩn Methylovorus mays và Methylomonas methanica vào môi trƣờng
nuôi cấy invitro tạo mối liên kết bền vững giữa vi khuẩn và mô thực vật [39], [40]. Thuốc lá, cây lanh và khoai tây khi nhiễm vi khuẩn tăng trƣởng mạnh hơn so với đối chứng (số chồi tăng, rễ phát triển mạnh), ngay cả trên môi trƣờng không có vitamine [35].
Hình 2.5: Sự tái sinh chồi của loài cây thuốc lá chuyển gen ipt trên môi trƣờng MS không bổ sung hormone sau một tháng nuôi cấy. (a): không bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays. (b): có bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays [39] Theo Maliti (2000), so với các vi khuẩn liên kết với thực vật khác thì vi khuẩn Methylobacterium sp. là loài tồn tại lâu dài và chiếm tỉ lệ lớn nhất khi bề mặt lá đƣợc rửa sạch [46]. Holland và cộng sự (1994) đã đề cập đến việc khử trùng thông thƣờng trong khâu chuẩn bị nuôi cấy mô không loại trừ đƣợc
Methylobacterium sp., dù đã xử lý với hypochlorite và cồn nhƣng các mô sẹo phát
sinh từ mẫu cấy này vẫn có nguy cơ bị nhiễm PPFM [35]. Đây là nhóm vi khuẩn rất phong phú và không gây bệnh thực vật. PPFM chiếm tỷ lệ lớn và có mật độ từ 104 đến 107 đơn vị khuẩn lạc (cfu) trên mỗi gram trọng lƣợng tƣơi của mô thực vật [35]. Chúng lây nhiễm qua hạt [26], ở hạt đậu nành khô mật độ là 105 cfu/gram [35].
Tuy PPFM không tăng trƣởng nhanh nhƣ các vi khuẩn vùng lá khác trên môi trƣờng giàu dinh dƣỡng nhƣng chúng vẫn có khả năng cạnh tranh tạo khuẩn lạc trên lá. Một số tác giả cho rằng dinh dƣỡng methyl tuỳ ý ở PPFM là một phần lý do duy trì mối quan hệ giữa chúng với thực vật. Bằng cách sử dụng nguồn thức ăn khác thƣờng là methanol, PPFM có thể loại bỏ chất độc này khỏi mô thực vật
