Nguồn gốc Malt Nấm mốc Vi khuẩn Nhiệt độ tối thích (oC) 72-75 50-60 60-70 pH tối thích 5,3-5,8 5,0-6,0 6,0-7,0 (Nguồn: Lượng và ctv., 2004)
2.4.1. Enzyme β-amylase (EC 3.2.1.2)
β-amylase được dùng trong quá trình thủy phân tinh bột và ứng dụng chính là để sản xuất si rơ maltose (Bentley et al., 1996; Shaw et al., 1999). Phần lớn enzyme β- amylase được tinh sạch từ nguồn thực vật và vi khuẩn (Ray et al., 1996; Pandey et al.,
trong dung dịch tinh bột thuần khiết của β-amylase là 4,6, còn trong dung dịch nấu (khơng sơi) là 5,6. Nhiệt độ tối thích trong dung dịch tinh bột thuần khiết là 40 ‒ 50oC, còn trong dung dịch nấu là 60 ‒ 65oC.
Enzyme β-amylase là một loại exoamylase. Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu khơng khử của các nhánh ngồi cùng của cơ chất. Enzyme β-amylase cắt liên kết α-1,4- glycoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4-glycoside đứng kế cận α-1,6-glycoside thì nó ngưng tác dụng. Phần saccharide cịn lại là dextrin phân tử lớn, có chứa nhiều liên kết α-1,6-glycoside. β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose, khoảng 54 ‒ 58% amylopectin thành maltose. Sản phẩm tạo thành là đường maltose nên β-amylase còn được gọi là enzyme đường hóa.
Nếu tinh bột bị thủy phân đồng thời bởi cả α-amylase và β-amylase thì lượng tinh bột sẽ bị thủy phân khoảng 95%. Cả 2 enzyme này đều không cắt được nối α-1,6- glycoside trong phân tử tinh bột. Kết quả tác dụng của α-amylase và β-amylase ta thu được dịch đường gồm 78 ‒ 80% maltose và glucose, 20 ‒22% là dextrin chứa các nối α-1,6-glycoside.
β-amylase còn được ứng dụng trong việc cải thiện khả năng tiêu hóa chậm của tinh bột bắp (Miao et al., 2014a). Kết quả cho thấy rằng khi sử dụng β-amylase để biến tính tinh bột bắp trong 2 giờ thì có sự gia tăng giá trị SDS (slowly digestible starch) từ 11,16 lên 24,38%; hàm lượng amylose tăng từ 28,4 lên 32,5%; số liên kết α-1,6-glycoside tăng từ 7,4 lên 10,1%; khối lượng phân tử giảm từ 32,5.107 xuống còn 3,8.105g/mol.
2.4.2. Enzyme Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase (BSMA)2.4.2.1. Tên gọi và nguồn gốc 2.4.2.1. Tên gọi và nguồn gốc
Maltogenic amylase (EC.3.2.1.133) cịn có các tên gọi khác như: 1,4-alpha-D- glucan alpha-maltohydrolase; Maltogenic α-amylase; Glucan 1,4-α-maltohydrolase.
Maltogenic amylase được phân lập từ các vi khuẩn gram dương, sống ở đất gồm có các vi khuẩn thuộc lồi Bacillus như: B. stearothermophilus, B. subtilis, B.
licheniformi, B. thermoalkalophiluss (Cha et al., 1998; Kim et al., 1999; Bae et al.,
2002; Shim et al., 2002; Kim et al., 2003). Bên cạnh đó, BSMA cịn được phát hiện ở các vi khuẩn chịu nhiệt gram âm thuộc chủng Thermus sp như: Thermus sp. 314,
Thermus sp. 4-1A, Thermus sp. A4, Thermus sp. ATN1, Thermus sp. IM6501, Thermus
sp. TAK16D, Thermus sp. X-1, Thermus sp. Y5, Thermus sp. Z05 (Kim et al., 1999). Ngoài ra, Oh et al. (2005) lần đầu tiên phát hiện BSMA được phân lập từ Lactobacillus
gasseri ATCC 33323.
Maltogenic amylase thuộc phân họ của họ các enzyme thủy phân liên kết glycoside GH13 cùng với các enzyme khác như cyclodextrinase (EC 3.2.1.54),
pullulasnase (EC 3.2.1.135) và Thermoactinomyces vulgaris R-47 α – amylase II (Kim
2.4.2.2. Các đặc tính của maltogenic amylase
Maltogenic amylase thể hiện những đặc tính khác so với các loại amylase khác. Maltogenic amylase không được tiết ra ngoài tế bào mà là một enzyme liên kết với màng tế bào (Kim et al., 1999; Tang et al., 2006). Maltogenic amylase thể hiện tác động kép lên cơ chất, có khả năng cắt được liên kết α-1,4 và α-1,6 glycoside; chuyển liên kết α- 1,4 thành α-1,6, α-1,3 hoặc α-1,4 khác (Bae et al., 2002). Đặc biệt maltogenic amylase có khả năng thủy phân acarbose, một pseudotetrasaccharide có khả năng ức chế mạnh một số enzyme carbohydrase như các loại bao gồm: α–amylase, α–glucosidase và cyclodextrin glycosyltransferases (CGTase). Hơn nữa, maltogenic amylase không chỉ cắt liên kết glycoside đầu tiên của phân tử acarbose mà còn chuyển acarviosine – glucose (sản phẩm thủy phân) đến các phân tử carbohydrate tiếp nhận.
Maltogenic amylase còn được biết đến như một loại enzyme có thể chuyển các mono và disaccharide đến nhiều loại phân tử tiếp nhận khác nhau (Kim et
al., 1999; Bae et al., 2002). Maltogenic amylase hoạt động mạnh trên cơ chất
cyclodextrin (CD) hơn là trên tinh bột hoặc pullulan, enzyme này phân giải cơ chất β- CDs (7 đơn vị glucose) nhanh hơn 100 lần so với tinh bột hoặc pullulan. Ngược lại, các amylase khác với một đặc tính thủy phân khơng thể phân giải CDs hoặc pullulan. Maltogenic amylase cắt liên kết α-1,4 hiệu quả hơn α-1,6, với nồng độ cơ chất thấp sản phẩm tạo thành chủ yếu là maltose vì vậy enzyme này có tên là “maltogenic amylase”. So sánh với CGTases hoạt tính chuyển glycoside của maltogenic amylase yếu hơn nhiều bởi vì maltogenic amylase chủ yếu chuyển cơ chất thành các sản phẩm thủy phân (Cha
et al., 1998; Kim et al., 1999; Bae et al., 2002).
BSMA từ các nguồn khác nhau thì có các điều kiện phản ứng tối ưu khác nhau. Nhìn chung, nhiệt độ tối ưu cho các BSMA hoạt động từ 40 ‒ 60oC. Hiện tại, BSMA chịu nhiệt độ cao nhất được phân lập từ chủng Thermus sp. IM6501 (ThMA), có nhiệt độ hoạt động tối ưu là 60oC (Shim et al., 2002; Kim et al., 2003; Oh et al., 2005).
Hình 2.8: Cơ chế phản ứng của enzyme BSMA
(Nguồn: Lê Quang Trí và ctv., 2008)
Khả năng chịu nhiệt là một trong những đặc tính quan trọng nhất của enzyme sử dụng trong công nghiệp, đặc biệt là các enzyme sử dụng trong ngành công nghiệp chế biến tinh bột. Vì vậy đã có rất nhiều cơng trình nghiên cứu nhằm tăng khả năng chịu nhiệt của BSMA bằng cách gây biến đổi gen. Kim et al., 2002 đã biến đổi gen của chủng vi khuẩn Thermus sp. IM6501, các chủng vi khuẩn đột biến cho sản phẩm BSMA
(ThMA-DM) có khả năng chịu nhiệt lên tới 75oC. ThMa-DM chỉ giảm ½ hoạt tính sau 172 phút ở nhiệt độ 80oC, trong khi đó ở nhiệt độ này enzyme ThMA từ chủng tự nhiên bị mất hồn tồn hoạt tính trong vịng 1 phút (Kim et al., 1999; Whitehurst & Law, 2002; Tang et al., 2006; ) đã tạo ra loại BSMA chịu nhiệt bằng việc đột biến vi khuẩn
B. thermoalkalophilus ET2 (BTMA). BTMA mới này có nhiệt độ tối ưu là 80oC và mất 85% hoạt tính ở 85oC. Thời gian enzyme bị mất ½ hoạt tính ở 85oC cao hơn gấp 3 lần so với ThMA (Tang et al., 2006) (Hình 2.9).
2.4.2.3 Ứng dụng của enzyme BSMA
Lee et al., 2002 đã kết hợp α-Glucanotransferase và maltogenic amylase trong việc cải tiến quy trình sản xuất đường isomalto oligosaccharide (IMO). Khi xử lý kết hợp cả 2 loại enzyme thì hàm lượng IMO có thể lên đến 68% (Hình 2.10).
Hình 2.10: So sánh quy trình sản xuất IMO truyền thống và quy trình cải tiến
(Nguồn: Lee et al., 2002)
Tri và ctv., 2009 đã biến tính tinh bột khoai mì bằng việc xử lý kết hợp enzyme phân nhánh và maltogenic amylase. Đầu tiên tinh bột khoai mì sẽ được biến tính bằng enzyme phân nhánh từ Bacillus subtilis 168, sản phẩm tiếp tục được phân nhánh bằng BSMA để tạo tinh bột khoai mì có mức độ phân nhánh cao.
Miao et al., 2014b đã nghiên cứu thành cơng tinh bột bắp tiêu hóa chậm bằng việc sử dụng enzyme maltogenic amylase. Khi tinh bột bắp được xử lý bằng BSMA trong 6 giờ thì có sự gia tăng giá trị SDS (slowly digestible starch) từ 11,1 lên 19,6%.
2.5. Quá trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose bằng enzyme maltogenicamylase amylase
2.5.1. Hoạt tính chuyển hóa của enzyme
Các phản ứng chuyển hóa được biết đến để biến đổi một số đặc tính của các chất như glycoside. Có rất nhiều sản phẩm chuyển hóa được tạo thành giữa chất cho (R1- glycoside, Hình 2.11) và nhiều loại chất nhận khác nhau (R2-glycoside, Hình 2.11) bằng việc sử dụng enzyme riêng biệt để thực hiện các phản ứng chuyển hóa. Tính đặc hiệu của q trình chuyển hóa phụ thuộc vào loại enzyme, cấu hình của liên kết glycoside được tạo thành giữa phân tử chất cho và chất nhận (Park et al., 2012).
Hình 2.11: Phản ứng chuyển hóa dùng enzyme giữa đoạn chất cho và chất nhận
(Nguồn: Park et al., 2012)
Các phương pháp chuyển hóa dùng enzyme có nhiều thuận lợi hơn so với phương pháp hóa học trong việc tổng hợp các oligosaccharides và dẫn xuất của chúng như các bước phản ứng ít hơn, quy trình tinh chế đơn giản hơn và năng suất cao hơn (Park et al., 2012).
Phản ứng chuyển hóa của enzyme xảy ra giữa oligosaccharide (chất cho) và một lượng lớn các phân tử chất nhận khác nhau như các hợp chất có hoạt tính sinh học. Các enzymes như maltogenic amylase (MAase), α-glucanotransferase (α-GTase), β-
glucosidase và cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) đều có liên quan đến q trình biến đổi sinh học này. CGTase có thể chuyển hóa đơn vị glucoside đến phân tử chất nhận bằng cách hình thành liên kết α-(1,4) hoặc liên kết α-(1,3)-glycoside (Kometani et
al., 1996). β-glucosidase từ Sulfolobus solfataricus và Pyrococcus furiosus tạo liên kết
β-(1,3) và β-(1,6)-glycoside thơng qua phản ứng chuyển hóa giữa các phân tử và trong phân tử. BSMA thủy phân cyclomaltoheptaose, pullulan, tinh bột, acarbose và thể hiện hoạt tính chuyển hóa, chuyển maltose và glucose đến phân tử chất nhận bằng cách tạo liên kết α-(1,4) và α-(1,6)-glycoside (Baek et al., 2003). Enzyme này không những chuyển các mono và disaccharides mà cịn có khả năng chuyển nhiều hợp chất có cấu trúc khác nhau như hợp chất đường rượu, flavonoids (Lee et al., 1999) và acid ascorbic (Bae et al., 2002). Nhiều phân tử sinh học quan trọng có thể bị biến tính bằng phản ứng chuyển hóa dẫn đến các tính chất của chúng cũng thay đổi theo (Lee et al., 1999; Cho
et al., 2000; Meulenbeld & Hartmans, 2000; Bae et al., 2002; Baek et al., 2003). Hình
2.12 trình bày tổng quát việc kết hợp q trình thủy phân và chuyển hóa bằng enzyme maltogenic amylase.
Hình 2.12: Mơ hình tổng qt kết hợp q trình thủy phân và chuyển hóa bằng enzyme maltogenic amylase
(Nguồn : Cha et al., 1998)
2.5.2. Quá trình tổng hợp phức puerarin-maltose
Li et al., 2004 đã nghiên cứu khả năng chuyển hóa của enzyme để kiểm tra tính đặc hiệu chấp nhận đối với puerarin. Bốn loại enzyme đã được sử dụng: BSMA (EC 3.2.1.133), T. maritima maltosyl-transferase (TMMT; EC 3.2.1.25), T. scotoductus 4-α- glucanotransferase (TS4αGTase; EC 3.2.1.25) và Bacillus sp. I-5 cyclodextrin
glucanotransferase (BSCGTase; EC 3.2.1.19). Để làm sáng tỏ q trình chuyển hóa, tác giả sử dụng maltotriose làm phân tử chất nhận. Phản ứng được thực hiện với 1% puerarin và 5% maltotriose. Kết quả cho thấy TMMT và TS4αGTase tạo thành rất ít các sản phẩm chuyển hóa của puerarin (Hình 2.13a: giếng 3 và 5) mặc dù các enzyme này đã thủy phân và chuyển hóa maltotriose (Hình 2.13b: giếng 3 và 5). Điều này cho thấy TMMT và TS4αGTase khơng có tính đặc hiệu chấp nhận đối với puerarin do khơng tạo thành liên kết O-glucoside giữa D-glucose và 7-OH-daidzein. Ngược lại, BSMA và BSCGTase tạo thành một lượng lớn các sản phẩm chuyển hóa của puerarin (Hình 2.13a: giếng 2 và 4).
Hình 2.13: Kết quả phân tích TLC của các sản phẩm chuyển hóa giữa puerarin và maltotriose bằng 4 loại enzyme chuyển hóa khác nhau. 1. Puerarin, 2. BSMA, 3. TMMT, 4.
BSCGTase, 5. TS4αGTase
a. Các điểm được quan sát ở bước sóng 254 nm đối với isoflavonesb. Các điểm quan sát trong dung dịch 110oC, 10 phút đối với carbohydrate b. Các điểm quan sát trong dung dịch 110oC, 10 phút đối với carbohydrate
(Nguồn: Li et al., 2004)
Kết quả phân tích TLC đã chỉ rõ có ít nhất 8 điểm phân biệt bao gồm 2 điểm chính (dưới điểm puerarin), điều này cho thấy BSMA đã thực hiện phản ứng chuyển hóa một cách tuyệt đối so với các enzyme còn lại. BSMA ưu tiên chuyển hóa đơn vị maltose được giải phóng từ q trình thủy phân đến phân tử chất nhận bằng cách hình thành liên kết α-(1,6)-glycoside giữa chất cho và chất nhận (Cha et al., 1998). Xét một loạt các sản phẩm chuyển hóa được hình thành trong phản ứng của BSMA, tác giả giả định cả maltose và glucose được tạo ra từ phân tử chất cho đều được chuyển hóa đến phân tử chất nhận bằng cách hình thành liên kết α-(1,3)- hoặc α-(1,6)-glycoside. Cơ chế phản ứng của BSMA với puerarin và maltotriose được thể hiện trong Hình 2.14. Đầu tiên, BSMA tấn cơng và thủy phân chất cho (maltotriose) để tạo thành phức trung gian giữa cơ chất thủy phân (maltose hoặc glucose) và enzyme. Sau đó, nước hoặc phân tử chất nhận (puerarin hoặc maltooligosaccharide) tấn công phức hợp trung gian trong hỗn hợp phản ứng. Chính vì thế, 3 loại sản phẩm phản ứng do BSMA được hình thành: các sản phẩm của quá trình thủy phân, các sản phẩm maltooligosyl-transglycosylation (Hình 2.13b: giếng 2) và các sản phẩm chuyển hóa puerarin (Hình 2.13a: giếng 2).
Hình 2.14: Cơ chế phản ứng chuyển hóa puerarin bằng Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase (BSMA)
(Nguồn: Li et al., 2004)
Khi các sản phẩm chuyển hóa của puerarin (maltosyl-α-(1-6)-puerarin, glucosyl- α-(1-6)-puerarin) được tạo thành thì độ hịa tan cải thiện rõ rệt so với puerarin. Kết quả được thể hiện trong Bảng 2.10.
Bảng 2.10: Độ hịa tan của puerarin và các sản phẩm chuyển hóa của puerarin Isoflavones
Puerarin
Glucosyl-α-(1-6)-puerarin Maltosyl-α-(1-6)-puerarin
Độ hòa tan trong nước (mM) 12,45±0,11 178,59±2,48 2094,56±21,77
Độ hòa tan tương đối 1 14 168
(Nguồn: Li et al., 2004)
Khi sử dụng tinh bột hòa tan để làm cơ chất cho q trình chuyển hóa của puerarin, Li et al., 2004 đã đưa ra kết quả: hiệu suất tạo thành các sản phẩm chuyển hóa của puerarin đạt 40,9% khi sử dụng 0,5% tinh bột, 1% puerarin; trong khi đó hiệu suất đạt 66,6% khi sử dụng 5% maltotriose làm cơ chất dưới cùng điều kiện phản ứng 55°C, 55 phút, nồng độ BSMA 1 U/mg. Khi tăng nồng độ tinh bột đến 5% thì hiệu suất tạo thành các sản phẩm chuyển hóa tăng đến 70%. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ trên 5% thì khơng sử dụng được do độ nhớt của hỗn hợp phản ứng cao. Khi nồng độ tinh bột ít hơn 1% thì maltosyl-α-(1-6)-puerarin tạo thành là chủ yếu, và glucosyl-α-(1-6)-puerarin chiếm ưu thế hơn khi nồng độ tinh bột lớn hơn 1% (Hình 2.15).
Hình 2.15: Sự thay đổi nồng độ isoflavone theo nồng độ tinh bột trong phản ứng chuyển hóa bằng BSMA (G1: Glucose G2: Maltose)
(Nguồn: Li et al., 2004)
2.5.3. Các ứng dụng hoạt tính chuyển hóa của enzyme
Neohesperidin dihydrochalcone (NHDC), một hợp chất đường có trong các loại trái cây họ citrus đã được biến tính bằng cách sử dụng hoạt tính chuyển hóa của enzyme BSMA. Maltotriose được dùng làm cơ chất (chất cho) phản ứng với NHDC (chất nhận) để thực hiện q trình chuyển hóa với mục đích chính là tăng độ hịa tan của NHDC. Các sản phẩm chuyển hóa được thể hiện trong Hình 2.16. Kết quả đã chỉ ra rằng maltosyl-NHDC là sản phẩm chuyển hóa chính trong số các sản phẩm chuyển hóa của phản ứng khi phân tích TLC. Maltosyl-NHDC có độ hịa tan 700 lần trong nước và độ ngọt ít hơn 7 lần so với NHDC (Cho et al., 2000).
Hình 2.16: Phản ứng chuyển hóa của NHDC bằng BSMA G1: glucose, G2: maltose, G3: maltotriose
Roh et al, 2005.đã sử dụng BSMA để chuyển hóa hợp chất tagatose-đồng phân của galactose và các tính chất lý hóa của các hợp chất chuyển hóa cũng được tác giả phân tích. Tác giả sử dụng cơ chất là maltotriose và tagatose là chất nhận để thực hiện phản ứng chuyển hóa. Kết quả maltosyl-tagatose là sản phẩm chính của q trình chuyển hóa, glucosyl-tagatose được tạo thành từ maltosyl-tagatose bằng cách loại bớt một nhóm glucose dưới tác dụng của glucoamylase (Hình 2.17). Phân tích Nuclear Magnetic Resonance (NMR) cho thấy liên kết 1,1-α-glucosyl-tagatose được tạo thành từ C1 của glucose và C1 của tagatose. Các phép đo độ ẩm cho thấy glucosyl-tagatose có sự hấp thụ nước lớn hơn so với tagatose hoặc sucrose. Nhiệt độ chuyển pha thủy tinh của glucosyl-tagatose là -29oC, cao hơn đáng kể so với tagatose (-45oC). Cấu trúc và tính chất hóa lý của chúng đã cho thấy rằng glucosyl-tagatose có khả năng là một chất làm lạnh và chất tạo ngọt ít calo.
Hình 2.17: Quá trình tổng hợp glucosyl-tagatose từ maltotriose và tagatose bằng phản ứng chuyển hóa và thủy phân
(Nguồn: Roh et al., 2005)
Các nghiên cứu trước đây sử dụng maltotriose (chất cho) và BSMA từ E. coli tái tổ hợp để thực hiện phản ứng chuyển hóa puerarin (chất nhận) (Li et al., 2004). Choi et
al., 2010 đã ứng dụng hoạt tính chuyển đổi của BSMA để cải thiện độ hịa tan của
puerarin với cơ chất sử dụng là maltodextrin. Kết quả phản ứng chuyển hóa puerarin sử dụng BSMA thơ với lượng tương đối của các hợp chất là: maltosyl-α-(1-6)-puerarin, glucosyl-α-(1-6)-puerarin, glucosyl-α-(1-3)-puerarin và puerarin được xác định tương ứng là 26:18:7:49 (Hình 2.18). Trải qua quá trình tinh sạch 2 bước, sản lượng thu được
Hình 2.18: Q trình chuyển hóa puerarin bằng BSMA
(Nguồn: Choi et al, 2010)
Park Kwan Hwa et al., 2012 đã nghiên cứu quá trình biến đổi sinh học của hợp chất isoflavone bằng hoạt tính chuyển đổi của enzyme MAase (Hình 2.19). Các MAase