CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.5. Phương pháp đánh giá tính chất vật liệu
2.3.5.1. Phương pháp đánh giá cảm quan, kích thước hạt, hệ số đa phân tán và thế zeta
- Cảm quan: nanoliposome ổn định (không xuất hiện các hiện tượng kém bền: kết bông, nổi kem, lắng cặn, tách lớp…).
- Kích thước, hệ số đa phân tán và thế zeta: được xác định bằng thiết bị Horiba Nano SZ100 tại Trung tâm phân tích Sinh-Hóa-Lý tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng Tp. Hồ Chí Minh.
Trong đó, hệ số phân tán (PDI) là một thông số quan trọng cho biết về sự phân bố kích thước hạt trong một mẫu nhất định. PDI nằm trong khoảng từ 0,0 (đối với mẫu hoàn toàn đồng nhất về kích thước hạt) đến 1,0 (đối với mẫu có độ phân tán cao với nhiều kích thước hạt). PDI < 0,05 cho thấy mẫu đơn phân tán cao và PDI > 0,7 cho thấy rằng mẫu có phân bố kích thước hạt rất rộng và khơng thích hợp để phân tích bằng kỹ thuật tán xạ ánh sáng động (DLS) [60]. PDI được tính theo cơng thức [61]:
PDI= (SD d )
2
2.3.5.2. Phương pháp xác định cấu trúc nanoliposome
Cấu trúc nanoliposome được xác định bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (Tranmission Electron Microscope-TEM), điện thế gia tốc 100kV tại Phịng thí nghiệm trọng điểm polyme và compozit – Đại học Bách khoa Tp. Hồ Chí Minh.
2.3.5.3. Phương pháp xác định cấu trúc vật liệu mPEG-Chol, mPEG-CS và mPEG-Gel
Cấu trúc sản phẩm thu được xác định bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- NMR và phổ hồng ngoại biến đổi FT-IR. Thiết bị NMR (Bruker) được đặt tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội. Máy quang phổ FT-IR (PerkinElmer) được đặt tại viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ, Tp. Hồ Chí Minh.
2.3.5.4. Phương pháp đánh giá độ ổn định trong huyết thanh
Tính ổn định trong huyết thanh là một trong những thơng số chính để đánh giá khả năng ứng dụng in vivo của vật liệu mang thuốc. Hệ nanoliposome và nano
liposome biến tính PEG mang thuốc được ủ trong môi trường chứa 50% huyết thanh thai bò (Fetal Bovine Serum, FBS) trong 24 giờ và được đo độ hấp thu tại các mốc thời gian khảo sát.
Phương pháp đo độ đục được sử dụng để đánh giá độ ổn định trong huyết thanh của các hệ nanoliposome tổng hợp [62,63]. Sự thay đổi độ đục được xác định bằng máy đọc hệ thống xét nghiệm miễn dịch bán tự động HumanReader HS (Human, Germany) tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ, Tp. Hồ Chí Minh.
2.3.5.5. Phương pháp xác định hiệu suất nang hóa (DLE) và khả năng mang thuốc (DLC)
a. Phương pháp định lượng paclitaxel bằng HPLC - Điều kiện:
Hệ thống: HPLC Flexar perkinElmer, Mỹ. Cột phân tích: C18 (4,6 mm x 12,5 cm; 5 µm). Đầu dị: Plexar PDA Plus
Bước sóng phát hiện: 214 nm
Pha tĩnh: Cột Zorbac Eclipse XPD C18 (250x4,6), kích thước hạt nhồi 5 μm. Pha động: Acetonitrile:Nước (95:5)
Dung môi pha mẫu: Acetonitrile. Nhiệt độ cột: 45oC. Tốc độ dịng: 1,8 mL/phút. Thể tích tiêm mẫu: 20 µl
- Định lượng paclitaxel được nang hóa vào nanoliposome: nanoliposome nang hóa paclitaxel được pha loãng trong nước cất. Mẫu được ly tâm với tốc độ 16000 vòng/phút trong 30 phút. Paclitaxel tự do không tan trong nước ở dạng kết tủa được định lượng bằng HPLC.
b. Phương pháp định lượng carboplatin bằng ICP-MS - Điều kiện:
Hệ thống: PerkinElmer Nexion 2000, Mỹ
Chế độ và điều kiện phân tích: Standard Mode (Nebulizer Gas Flow 1,02; Plasma Gas Flow 15; Auxillary Gas Flow 1,2; tốc độ bơm nhu động 60 rpm); Analyte: Pt.
Sử dụng bộ tiêm mẫu tự động Autosampler, hao hụt thể tích trung bình 3 mL/mẫu/ lần đo.
- Định lượng carboplatin được nang hóa vào nanoliposome: carboplatin tự do sẽ được loại đi bằng thẩm tách qua màng trong 4 giờ bằng nước cất. Thuốc nang hóa và thuốc tự do sẽ được xác định bằng ICP-MS.
c. Phương pháp xác định DLE và DLC Hiệu suất nang hóa thuốc: DLC% = mT-NH
mT-BĐx100% Khả năng mang thuốc: DLE% = mT-NH
mT-NH + mCMx100% Trong đó:
- mT-NH : Khối lượng thuốc được nang hóa (mg) - mT-BĐ : Tổng khối lượng thuốc ban đầu (mg) - mCM : Khối lượng chất mang
d. Phương pháp đánh giá khả năng phóng thích thuốc
Quy trình phóng thích paclitaxel được thực hiện bằng cách cho nanoliposome biến tính PEG mang thuốc (100 mg) và thuốc nguyên liệu (cân lượng thuốc bằng đúng lượng thuốc có trong 100 mg nanoliposome biến tính PEG mang thuốc) hịa tan trong 1 mL nước cất. Mỗi mẫu cho vào 3 màng thẩm tách cellulose MWCO 3,5 kDa. Tiến hành thẩm tách trong 20 mL PBS (pH 7,4) ở 37oC. Sau mỗi
khoảng thời gian nhất định lấy mỗi mẫu 1 mL và thêm vào lại tương ứng 1 mL PBS (pH 7,4) cho đủ 20 mL ban đầu. Hàm lượng thuốc (µg/mL) có trong các mẫu theo thời gian được xác định bằng HPLC đối với paclitaxel và ICP-MS đối với carboplatin.
b. Mơ hình động học phóng thích thuốc
Bốn mơ hình động học phóng thích thuốc (bậc khơng, bậc một, Higuchi và Korsmeyer-Peppas) được sử dụng để phân tích các dạng phóng thích thuốc in vitro của thuốc nguyên liệu và thuốc được nang hóa trong nanliposome biến tính PEG [64,65]. Mơ hình động học bậc khơng được sử dụng để kiểm tra mối quan hệ giữa thời gian và phần trăm tích lũy phóng thích thuốc. Mơ hình động học bậc nhất được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa thời gian và log phần trăm tích lũy thuốc cịn lại. Mơ hình Higuchi được sử dụng để đánh giá mối quan hệ giữa căn bậc hai của thời gian và phần trăm tích lũy phóng thích thuốc. Mơ hình Korsmeyer-Peppas được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa thời gian và log tích lũy phóng thích thuốc. Đồ thị của các mơ hình này được tạo dựa trên các phương trình tương ứng bằng cách sử dụng Microsoft Excel.
- Mơ hình bậc khơng mơ tả sự phóng thích thuốc khơng phụ thuộc vào nồng độ: C=k0t
Đối với mơ hình bậc khơng, thuốc được phóng thích với một lượng thuốc như nhau tại mỗi mốc thời gian khảo sát. Những ví dụ phóng thích thuốc tn theo mơ hình bậc khơng: thẩm thấu qua da, cấy ghép tại chỗ, dùng qua đường uống, viên nén chứa thuốc có độ tan thấp, huyền phù…
- Mơ hình bậc một mơ tả sự giải phóng thuốc phụ thuộc vào nồng độ: log(100 - C)= - kft
2,303
⁄
Hệ phóng thích thuốc tn mơ hình bậc một: phóng thích thuốc có kiểm sốt, khuếch tán có kiểm sốt, phóng thích liên tục…
- Mơ hình Higuchi mơ tả sự phóng thích thuốc khỏi hệ thống: C=kH√t
Mơ hình Higuchi mơ tả việc phóng thích thuốc là một quá trình khuếch tán dựa trên định luật Fick. Những ví dụ phóng thích thuốc tn theo mơ hình Higuchi:
thuốc tan trong nước (pentoxyphylline), thuốc kém tan trong nước (morphine), semisolids (gel diclofenac), chất rắn, miếng dán thẩm thấu qua da…
- Mơ hình Korsmeyer-Peppas mơ tả sự phóng thích thuốc khỏi hệ thống: C=kKtn
Đối với mơ hình Korsmeyer-Peppas, giá trị n được sử dụng để đặc trưng cho các cơ chế phóng thích thuốc khác nhau [66]:
n = 0,5: sự phóng thích thuốc tn theo khuếch tán Fickian
0,5 < n < 1: sự phóng thích thuốc khơng tn theo khuếch tán Fickian n =1: sự phóng thích thuốc tn theo mơ hình bậc 0 hoặc case-II n > 1: sự phóng thích thuốc tn theo super case-II
Trong đó, C là phần trăm thuốc tích lũy được giải phóng tại thời điểm t k0 là hằng số của mơ hình động học bậc khơng
kf là hằng số của mơ hình động học bậc một kH là hằng số Higuchi
kK là hằng số Korsmeyer-Peppas
n là số mũ mô tả cơ chế khuếch tán của thuốc ra khỏi hệ chất mang