Vị trí H H của nhóm Độ dịch chuyển hóa học (ẟ, ppm)
a -CH3 3,43 3,40 b -O-CH2-CH2- 3,63 – 3,86 3,68 – 3,87 c -CH2-CH2O-O- 3,87 – 3,94 3,99 d -CH2-O-NPC 4,52 – 4,57 f, g -CH=CH- (vòng thơm) 7,51 – 7,59 và 8,38 – 8,49 1,3,4,5,6,a,b,c –OCH3 3,55 – 4,01 2 -CH-NH- 3,01 7 -NH-CO-CH3 2,11
Kết quả thế hiện trong Bảng 3.12 cho thấy sản phẩm tổng hợp mPEG-CS
ngoài sự lặp lại các tín hiệu proton từ mPEG-NPC ở vị trí a, b, c cịn có sự xuất hiện thêm tín hiệu mới tại vị trí 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 và mất tín hiệu ở vị trí f, g do sự thay thế NPC từ mPEG-NPC thành mPEG-CS.
3.3.1.3. Kết quả khảo sát nồng độ mPEG-CS
Kết quả DLE và DLC của năm nồng độ mPEG-CS được sử dụng để tổng hợp hệ SLP@mPEG-CS được thể hiện trên Hình 3.14.
Hình 3.14. Hiệu suất mang thuốc (a) và khả năng mang thuốc (b) của hệ
Kết quả cho thấy hiệu suất mang thuốc và khả năng mang thuốc cho thấy tương tự với hệ liposome được biến tính PEG bằng vật liệu mPEG-Chol, DLE đối với PTX của hệ SLP@mPEG-CS cao hơn so với CAR. Kết quả này có thể được giải thích bằng tính tan của thuốc dẫn đến sự khác nhau về vị trí của thuốc trong hệ nanoliposome biến tính PEG. Tương tự với biến tính bằng vật liệu mPEG-Chol, chuỗi PEG của vật liệu mPEG-CS theo tương tác tĩnh điện sẽ phủ một lớp bên ngoài lớp phospholipid của liposome. Vì vậy, đối với khoang nước bên trong liposome, chuỗi PEG ưa nước cũng sẽ chiếm một khoảng không gian dẫn đến giảm khoảng khơng chứa thuốc ưa nước mà cụ thể trong thí nghiệm này là thuốc CAR.
Kết quả cho thấy sự gia tăng nồng độ mPEG-CS dẫn đến thay đổi DLE và DLC. Khi nồng độ mPEG-CS tăng từ 2% lên 8%, DLE tăng dần từ 64,53% lên 83,79% đối với PTX và tăng từ 47,33% đến 50,88% đối với CAR. Tuy nhiên, DLE không tăng thêm mà giảm dần khi nồng độ mPEG-CS tăng lên đến 10% ở cả hai thuốc. Kết quả này cho thấy rằng nồng độ mPEG-CS có tác động đáng kể đến DLE. Hiệu quả tải thuốc của SLP@mPEG-CS cũng được phát hiện là cao nhất ở nồng độ mPEG-CS là 8%. Vì vậy, nồng độ mPEG-CS 8% được chọn cho tổng hợp hệ nanoliposome biến tính PEG bằng mPEG-CS.
Kích thước và hệ số đa phân tán của SLP@mPEG-CS ở
Phụ lục 10 được thống kê qua Bảng 3.13.
Bảng 3.13. Kết quả DLS và thế zeta của sản phẩm SLP@mPEG-CS sau tổng hợp
và sau 1 tuần bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8oC
SLP@mPEG-CS Cảm quan Kích thước hạt (nm) Hệ số đa phân tán (PDI) Thế zeta (mV) Sau tổng hợp Trong 167,70 ± 10,47 0,326 ± 0,029 -54,67 ± 1,56 Sau 1 tuần Trong 166,45 ± 0,49 0,452 ± 0,061 -77,60 ± 1,71
3.3.2. Kết quả phủ mPEG-CS lên bề mặt nanoliposome và đánh giá tính chất vật liệu chất vật liệu
3.3.2.1. Kết quả nang hóa thuốc
SLP@mPEG-CS nang hóa PTX (PTX/SLP@mPEG-CS) và CAR (CAR/SLP@mPEG-CS) thông qua tương tác kỵ nước. Trong môi trường hydrat, nanoliposome tự lắp ráp nhờ vào tương tác kỵ nước để hình thành lớp đơi phospholipid. Sau đó, mPEG-CS được gắn vào bề mặt liposome nhờ vào lực tương tác tĩnh điện (mPEG-CS mang điện tích dương và liposome mang điện tích âm) tạo thành hệ nanoliposome được biến tính PEG bằng vật liệu mPEG-CS. Trong quá trình hydrat này, thuốc đồng thời cũng được mang vào hệ SLP@mPEG-CS nhờ vào tương tác kỵ nước. Trong đó, PTX sẽ nằm trong lớp đơi phospholipid và CAR sẽ nằm trong khoang nước của SLP@mPEG-CS.
a. Kết quả phân tích phổ FT-IR
Kết quả cho thấy các dao động đặc trưng của cả SLP và mPEG-CS đều xuất hiện trong phổ FT-IR của PTX/SLP@mPEG-CS và CAR/SLP@mPEG-CS: 1384 cm-1 là dao động của liên kết C-O và 2965 cm-1 là dao động liên kết C-H của chuỗi acid béo trên lecithin của SLP; ở 1421 cm-1 là của nhóm N-H nhóm chức đặc trưng của chitosan liên kết với mPEG, ở 1668 cm-1 là của nhóm carbonyl, ở 1122 cm-1 là của nhóm C-O-C, nhóm methylen xuất hiện ở số sóng 2989 cm-1 và ở 3489 cm-1 là của nhóm -OH.
1690 cm-1 là dao động của liên kết C-C và ở1278 cm-1 là dao động liên kết C-N trên phân tử PTX cho thấy xuất hiện trên PTX/SLP@mPEG-CS. Dao động của kết Pt-NH2 xuất hiện ở 1399 và 1392 cm-1 trên phân tử CAR cho thấy xuất hiện trên CAR/SLP@mPEG-CS [79].
Hình 3.15. Phổ FT-IR của SLP, mPEG-CS, PTX/SLP@mPEG-CS và
CAR/SLP@mPEG-CS
Dữ liệu phổ FT-IR của SLP, mPEG-CS, PTX/SLP@mPEG-CS và CAR/SLP@mPEG-CS theo Hình 3.15 được thống kê qua Bảng 3.14.
Bảng 3.14. Kết quả phổ FT-IR của SLP, mPEG-CS, PTX/SLP@mPEG-CS và
CAR/SLP@mPEG-CS Vị trí Nhóm chức Số sóng (cm-1) SLP mPEG -CS SLP@ mPEG -CS PTX CAR PTX/SLP @mPEG- CS CAR/SLP @mPEG- CS a -CH2 2900 2913 2922 2913 b C-O-C 1123 1121 1111 1147 d -C=O 1668 1694 1694 1694 g C-O- 1384 1303 1385 1303 1286 h C-H 2965 2987 2978 2954 Vị trí Nhóm chức Số sóng (cm-1) SLP mPEG -CS SLP@ mPEG -CS PTX CAR PTX/SLP @mPEG- CS CAR/SLP @mPEG- CS
i C-C 1690 1693 k C-N 1278 1294 l Pt-NH2 1399- 1392 1441 m N-H 1421 1478 1472 1471 n -OH 3489 3491 3490 3490
Qua bảng thống kê dữ liệu phổ của các chất (Bảng 3.14) cho thấy sự lặp lại các tín hiệu dao động đặc trưng trên phân tử mPEG-CS ở vị trí a, b, d, m, n và trên phân tử SLP ở vị trí g, h ln xuất hiện trong phân tử PTX/SLP@mPEG-CS và CAR/SLP@mPEG-CS sau khi tổng hợp. Trong phổ đồ của PTX/SLP@mPEG-CS xuất hiện các dao động ở vị trí i, k chứng tỏ đã nang hóa thành cơng PTX vào SLP@mPEG-CS. Trong khi đó, phổ đồ của CAR/SLP@mPEG-CS xuất hiện tín hiệu dao động tại vị trí l chứng tỏ đã nang hóa thành cơng CAR vào hệ SLP@mPEG-CS.
b. Kết quả TEM và DLS PTX/SLP@mPEG-CS
Hệ nanoliposome biến tính PEG bằng vật liệu mPEG-CS với nồng độ 8% mang thuốc PTX cho kết quả kích thước hạt trung bình là 121,27 nm với hệ số đa phân tán là 0,277 ± 0,018 và mang điện tích âm (-49,10 ± 2,30 mV). Kết quả TEM cho thấy PTX/SLP@mPEG-CS có dạng hình cầu (Hình 3.16.c).
Hình 3.16. Kết quả DLS (a), thế zeta (b) và TEM scale 200 nm (c) của
PTX/SLP@mPEG-CS CAR/SLP@mPEG-CS
Kết quả cho thấy kích thước trung bình của CAR/SLP@mPEG-CS là 151,13 nm với hệ số đa phân tán là 0,361 và thế zeta là -65,8 mV. Hình TEM biểu thị sự phân bố kích thước CAR/SLP@mPEG-CS cho thấy các hạt có dạng hình cầu.
Hình 3.17. Kết quả DLS (a), thế zeta (b) và TEM scale 200 nm (c) của
CAR/SLP@mPEG-CS
Kết quả kích thước và hệ số đa phân tán của hệ nanoliposome biến tính PEG bằng vật liệu mPEG-CS mang thuốc PTX, CAR đều cho thấy kích thước hạt nhỏ hơn 200 nm và hệ số đa phân tán < 0,5. Đây đều là những thông số phù hợp cho một hệ mang thuốc tiềm năng trong điều trị ung thư.
3.3.2.2 Kết quả đánh giá độ ổn định trong huyết thanh
Kết quả khảo sát độ ổn định trong huyết thanh của hệ SLP@mPEG-CS mang thuốc cho thấy rằng độ hấp thu của PTX/SLP@mPEG-CS và CAR/SLP@mPEG- CS có sự thay đổi trong 6 giờ đầu và duy trì ổn định trong 18 giờ tiếp theo (
Hình 3.18). Trong khi đó, độ ổn định của hệ liposome khơng biến tính
PTX/SLP và CAR/SLP cho thấy giảm độ hấp thu khi thời gian khảo sát tăng lên vì hệ đã lắng xuống dưới đáy ống nghiệm. Kết quả khảo sát cho thấy nanoliposome
biến tính PEG bằng mPEG-CS làm tăng tính ổn định của hệ nanoliposome trong huyết thanh.
Hình 3.18. Kết quả đánh giá sự thay đổi độ đục (được biểu thị bằng độ hấp thu) của
PTX/SLP@mPEG-CS (a, b) và CAR/SLP@mPEG-CS (c, d) khi ủ với 50% FBS
3.3.2.3. Kết quả đánh giá khả năng phóng thích thuốc
a. Paclitaxel
Kết quả khảo sát khả năng phóng thích thuốc PTX của hệ SLP@mPEG-CS được thể hiện trong Hình 3.19.
Hình 3.19. Kết quả phóng thích thuốc PTX ngun liệu, PTX được nang hóa trong
SLP và SLP@mPEG-CS trong môi trường PBS (pH 7,4)
Kết quả cho thấy PTX ngun liệu cho tốc độ phóng thích thuốc nhanh trong 12 giờ đầu khảo sát với 66,82% PTX được phóng thích. Trong khi đó, trong cùng khoảng thời gian 12 giờ khảo sát, 31,23% PTX được phóng thích từ liposome (PTX/SLP) và 21,87% PTX được phóng thích từ hệ liposome được biến tính PEG bằng vật liệu mPEG-CS (PTX/SLP@mPEG-CS). Sau 48 giờ khảo sát, 70,16% PTX được phóng thích từ PTX ngun liệu, 38,06% PTX được phóng thích từ PTX/SLP và 26,01% PTX được phóng thích từ PTX/SLP@mPEG-CS. Kết quả cho thấy cả ba hệ khảo sát đều cho thấy tốc độ phóng thích nhanh trong 12 giờ đầu và phóng thích chậm và duy trì tốc độ ổn định cho đến 48 giờ. Trong đó, hệ PTX/SLP@mPEG-CS cho khả năng phóng thích kéo dài hơn hệ nanoliposome chưa biến tính.
Mơ hình động học phóng thích thuốc:
Các tham số giải phóng động học và hệ số hồi quy được tính tốn từ bốn mơ hình động học được sử dụng để phân tích các dạng giải phóng thuốc in vitro của
PTX nguyên liệu và PTX được nang hóa trong SLP và PTX được nang hóa trong SLP@mPEG-CS (bậc không, bậc một, Higuchi và Korsmeyer-Peppas) được trình bày trong Bảng 3.15.
Bảng 3.15. Hằng số tốc độ và hệ số tương quan của PTX nguyên liệu, PTX được
nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-CS thu được thơng qua mơ hình động học bậc khơng, mơ hình động học bậc một, mơ hình Higuchi và mơ hình Korsmeyer-Peppas
Mơ hình bậc khơng Mơ hình bậc một Mơ hình Higuchi Mơ hình Korsmeyer- Peppas k0 R2 kf R2 kH R2 kK n R2 PTX 0,6757 0,5538 0,0030 0,5202 3,8331 0,6408 33,312 0,1750 0,7816 PTX/ SLP 0,4886 0,7393 0,0029 0,7787 2,4678 0,6898 13,219 0,3045 0,9023 PTX/ SLP@ mPEG -CS 0,1178 0,6230 0,0006 0,6341 1,2381 0,7962 9,587 0,1761 0,9153
Hình 3.20. Mơ hình động học giải phóng thuốc PTX nguyên liệu, PTX từ PTX/SLP
và PTX/SLP@mPEG-CS thơng qua bốn mơ hình động học: (a) Mơ hình bậc khơng, (b) Mơ hình bậc một, (c) Mơ hình Higuchi và (d) Mơ hình Korsmeyer-Peppas
Đối với mỗi mơ hình động học tương ứng, dạng phóng thích của PTX được nang hóa trong cả hai hệ nanoliposome và nanoliposome biến tính PEG bằng vật liệu mPEG-CS đều cho thấy mối tương quan cao nhất với mơ hình Korsmeyer- Peppas (R2 = 0,9023 đối với PTX/SLP và R2 = 0,9153 đối với PTX/SLP@mPEG- CS). Theo mơ hình Korsmeyer-Peppas, với giá trị n < 0,45, cả hai hệ SLP và SLP@mPEG-CS đều cho cơ chế phóng thích thuốc tn theo khuếch tán Fickian (n = 0,3045 đối với PTX/SLP và n = 0,1761 đối với PTX/SLP@mPEG-CS) [66]. Điều này có nghĩa là tốc độ phóng thích của thuốc PTX tỷ lệ với nồng độ thuốc PTX có trong hệ. Cũng trong mơ hình này, hằng số kk cho thấy xu hướng khi nang hóa thuốc vào SLP và SLP@mPEG-CS (kk = 33,312 đối với PTX; kk = 13,219 đối với PTX/SLP và kk = 9,587 đối với PTX/SLP@mPEG-CS). Kết quả này cho thấy tác động của hệ liposome đối với q trình phóng thích thuốc. Trong đó, việc biến tính bề mặt liposome bằng mPEG-CS cho thấy việc kéo dài phóng thích thc PTX (kk của PTX/SLP nhỏ hơn kk của PTX/SLP@mPEG-CS).
b. Carboplatin
Hình 3.21. Kết quả phóng thích thuốc CAR nguyên liệu, CAR được nang hóa trong
Kết quả so sánh khả năng phóng thích thuốc của CAR nguyên liệu, CAR/SLP và CAR/SLP@mPEG-CS cho thấy hệ CAR/SLP@mPEG-CS phóng thích thuốc chậm hơn và phần trăm CAR được phóng thích thấp hơn so với CAR nguyên liệu và CAR/SLP sau 48 giờ (Hình 3.21). Sau 48 giờ, 98,14% CAR được phóng thích từ CAR ngun liệu, 71,22% CAR được phóng thích từ hệ CAR/SLP và 51,02% CAR được phóng thích từ CAR/SLP@mPEG-CS. Kết quả đánh giá khả năng phóng thích thuốc của nanoliposome và nanoliposome biến tính mPEG-Chol cho thấy cả hai hệ đều cho thấy cơ chế phóng thích giống nhau. Sự phóng thích hồn toàn của thuốc CAR nguyên liệu xảy ra trong 48 giờ; trong khi thuốc được phóng thích từ hệ liposome và liposome được biến tính cho thấy phóng thích nhanh vào giai đoạn đầu, phóng thích chậm và khơng đổi vào giai đoạn hai. Kết quả trên cho thấy rằng việc thủy phân cấu trúc cao phân tử của hệ nanoliposome chưa biến tính và biến tính bằng vật liệu mPEG-Chol cần thời gian lâu hơn. Vì vậy, sự phóng thích thuốc sau 48 giờ khảo sát của cả hai hệ nanoliposome đều cho thấy sự phóng thích thuốc CAR chậm. Trong đó, hệ SLP@mPEG-CS cho thấy sự phóng thich CAR được kéo dài hơn so với SLP.
Mơ hình động học phóng thích thuốc:
Bảng 3.16. Hằng số tốc độ và hệ số tương quan của CAR, CAR/SLP và
CAR/SLP@mPEG-CS thu được thơng qua mơ hình động học bậc khơng, mơ hình động học bậc một, mơ hình Higuchi và mơ hình Korsmeyer-Peppas
Mơ hình bậc khơng Mơ hình bậc một Mơ hình Higuchi Mơ hình Korsmeyer- Peppas k0 R2 kf R2 kH R2 kK n R2 CAR 0,5095 0,8037 0,0232 0,9767 8,2091 0,4366 71,400 0,0839 0,9873 CAR /SLP 0,4684 0,6677 0,0053 0,7515 4,1583 0,3450 46,462 0,1214 0,9107 CAR /SLP@ mPEG 0,3607 0,6721 0,0027 0,7075 2,5845 0,3742 32,151 0,1318 0,9339
-CS
Các tham số giải phóng động học và hệ số hồi quy được tính tốn từ bốn mơ hình động học phóng thích thuốc của của CAR, CAR nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-CS được trình bày trong Bảng 3.16. Kết quả cho thấy CAR nguyên liệu cho giá trị R2 theo thứ tự giảm dần là 0,9873, 0,9767, 0,8037 và 0,4366 đối với các mơ hình lần lượt là mơ hình Korsmeyer-Peppas, mơ hình bậc một, mơ hình bậc khơng và mơ hình Higuchi. CAR/SLP cho giá trị R2 theo thứ tự giảm dần là 0,9107, 0,7515, 0,6677 và 0,3450 đối với các mơ hình lần lượt là mơ hình Korsmeyer- Peppas, mơ hình bậc một, mơ hình bậc khơng và mơ hình Higuchi. CAR/SLP@mPEG-CS cho giá trị R2 theo thứ tự giảm dần là 0,9339, 0,7075, 0,6721 và 0,3742 đối với các mơ hình lần lượt là mơ hình Korsmeyer-Peppas, mơ hình bậc một, mơ hình bậc khơng và mơ hình Higuchi. Dạng phóng thích của CAR ngun liệu, CAR nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-CS đều cho thấy mối tương quan cao nhất với mơ hình Korsmeyer-Peppas. Theo mơ hình này, với giá trị n < 0,45, cả 3 dạng phóng thích đều tn theo khuếch tán Fickian (n = 0,0839 đối với CAR, n = 0,1214 đối với CAR/SLP và n = 0,1318 đối với CAR/SLP@mPEG-CS) [66]. Bên cạnh đó, sự giảm giá trị hằng số kk bởi q trình nang hóa thuốc vào nanoliposome chưa biến tính và đã biến tính với vật liệu mPEG-CS (kk = 71,400 đối với CAR, kk = 46,462 đối với CAR/SLP và kk = 32,151 đối với CAR/SLP@mPEG-CS) cho thấy việc kéo dài phóng thích thuốc CAR khi nang hóa vào hệ nanoliposome và nanoliposome biến tính với vật liệu mPEG-CS.
Hình 3.22. Mơ hình động học giải phóng thuốc CAR ngun liệu, CAR từ CAR/SLP
và CAR/SLP@mPEG-CS thông qua bốn mơ hình động học: (a) Mơ hình bậc khơng, (b) Mơ hình bậc một, (c) Mơ hình Higuchi và (d) Mơ hình Korsmeyer-Peppas
Kết luận:
- Phổ FT-IR và phổ 1H-NMR cho thấy đã tổng hợp thành công mPEG-CS. - Kết quả khảo sát nồng độ mPEG-CS cho thấy với nồng độ 8% hiệu suất mang cả hai thuốc khảo sát là cao nhất (83,79% với PTX và 50,88% với CAR).
- Kích thước hạt của nanoliposome biến tính PEG bằng mPEG-CS là 167,70 nm. Hệ nanoliposome biến tính PEG bằng mPEG-CS mang thuốc PTX có kích thước hạt trung bình là 121,27 nm và mang thuốc CAR có kích thước hạt trung bình là 151,13 nm.
- Kết quả đánh giá độ ổn định trong huyết thanh của nanoliposome biến tính PEG bằng mPEG-CS cho kết quả ổn định trong huyết thanh trong 24 giờ khảo sát.