CHƯƠNG 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.3. Tối ưu hóa quá trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose dưới tác dụng của
4.3.1. Ảnh hưởng của pH đến q trình biến tính hợp chất puerarin dưới tác dụng của
4.3.1. Ảnh hưởng của pH đến q trình biến tính hợp chất puerarin dưới tácdụng của enzyme BSMA dụng của enzyme BSMA
Kết quả thống kê sự thay đổi hàm lượng puerarin dưới ảnh hưởng của pH được thể hiện trong Bảng 4.6.
Bảng 4.6: Sự thay đổi hàm lượng puerarin dưới ảnh hưởng của pH
STT pH Hàm lượng puerarin (mg/g) 1 4,5 6,84±0,22b 2 5 7,75±0,16c 3 5,5 7,10±0,22b 4 6 6,31±0,29a 5 6,5 6,31±0,27a
(Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%)
Kết quả thống kê cho thấy khi pH thay đổi từ 4,5 đến 6,5 thì hàm lượng puerarin tổng hợp được cũng thay đổi theo. Ở các giá trị pH 4,5; 5 và 5,5 hàm lượng puerarin tổng hợp được có khác biệt ý nghĩa so với pH 6 và 6,5, trong đó hàm lượng puerarin của mẫu ứng với giá trị pH 5 là cao nhất (7,75 mg/g) và khác biệt có ý nghĩa so với hàm lượng puerarin của các mẫu cịn lại. Kết quả này cho thấy hoạt tính của BSMA thể hiện rõ ở khoảng pH acid yếu (từ 4,5 đến 5,5) và cao nhất ở pH 5. Có thể đây là giá trị pH tối ưu cho hoạt tính xúc tác của enzyme BSMA. Ở pH tối ưu, vận tốc phản ứng xảy ra nhanh nhất, BSMA thể hiện hoạt tính chuyển hóa tốt nhất.
Maltogenic amylase thể hiện tác động kép lên cơ chất, có khả năng cắt liên kết α- 1,4 và α-1,6 glycoside; chuyển liên kết α-1,4 thành α-1,6, α-1,3 hoặc α-1,4 khác. Hơn nữa, maltogenic amylase không chỉ cắt liên kết glycoside đầu tiên của phân tử acarbose mà còn chuyển acarviosine-glucose (sản phẩm thủy phân) đến các phân tử carbohydrate tiếp nhận (Sihui Pa et al., 2019). Bacillus stearothermophilus maltogenic α-amylase (BSMA) có tác dụng cắt chuỗi bên của amylopectin có thể kết tinh, do đó hạn chế sự tái kết tinh của amylopectin và sự hình thành mạng lưới trong quá trình bảo quản (Seung- Hye Woo et al,
2020). BSMA thủy phân cyclomaltoheptaose, pullulan, tinh bột, acarbose và thể hiện hoạt tính chuyển hóa, chuyển maltose và glucose đến phân tử chất nhận bằng cách tạo liên kết α- (1,4) và α-(1,6)-glycoside (Baek et al., 2003). Cụ thể trong nghiên cứu này, BSMA chuyển các gốc đường glucose, maltose đến phân tử chất nhận (puerarin) để tạo thành các sản phẩm chuyển hóa của puerarin, qua đó làm tăng độ hịa tan của puerarin. Ngồi giá trị pH tối ưu thì hoạt tính của enzyme giảm, kết quả dẫn tới hàm lượng puerarin tổng hợp được cũng giảm theo.
pH là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme. pH trong mơi trường phản ứng có khả năng tác động lên trạng thái tích điện của nhóm carboxyl hoặc nhóm amin qua đó làm thay đổi các mối liên kết ion (vốn có chức năng tạo cấu hình 3D cho phân tử protein), chính vì vậy sẽ làm thay đổi cấu hình khơng gian của phân tử
enzyme (Hình 4.7). Độ pH ban đầu làm thay đổi trạng thái ion hóa của enzyme và cơ chất, phức hợp enzyme-cơ chất. Tại pH tối ưu, cấu hình khơng gian của enzyme hoặc trạng thái tích điện của cơ chất là phù hợp cho phản ứng xảy ra nhất. Ngồi pH tối ưu thì khả năng xúc tác của enzyme yếu hơn hoặc bị bất hoạt (Lê Ngọc Tú và ctv., 2002; Hoàng Kim Anh
và ctv., 2005; Shih et al., 2007). pH quá cao hoặc quá thấp sẽ làm ảnh hưởng đến điện tích
cũng như khả năng tích điện của enzyme và cơ chất, làm giảm hoặc mất khả năng kết hợp với cơ chất của enzyme. Do đó, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm hoặc bị mất (Zhiwen Cao et
al. 2019).
Hình 4.7: Cấu trúc 3D của phân tử protein
(Nguồn: Marks et al., 2011)
Nhiều tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp amylase của vi sinh vật và có những cơng bố rất khác nhau. Prajapati (2014) đã công bố pH tối ưu để B.amyloliquefaciens KCP2 sinh tổng hợp amylase cao là 8,0. Trong khi đó, kết quả từ nghiên cứu của Nguyễn Thế Trang và ctv., (2012) cho thấy, chủng Geobacillus sp. LP09 có hoạt tính α-amylase tốt nhất trong khoảng pH từ 6,5 ‒ 7,5. Ở pH 7 hoạt tính α- amylase cao nhất đạt 14,6 UI/mL. Ở pH 6 hoạt tính α-amylase thấp nhất chỉ đạt 13,2 UI/mL, trong khi đó ở pH 8 hoạt tính chỉ đạt 13,6 UI/mL.
Từ các phân tích trên, giá trị pH 5 được chọn là thơng số thích hợp cho q trình biến tính hợp chất puerarin dưới tác dụng của enzyme BSMA.