Mã hóa Tổng bình
phương Độ tự do bình phươngTrung bình Giá trị F Giá trị p
Model 1,01646 9 0,11294 90,54 0,0000
X4: nhiệt độ (0C) 0,075208 1 0,075208 82,90 0,0001 X5: thời gian (giờ) 0,00102704 1 0,00102704 1,13 0,3283
X6: nồng độ enzyme (U/g) 0,0213786 1 0,0213786 23,56 0,0028 X4X4 0,149055 1 0,149055 164,29 0,0000 X4X5 0,000873813 1 0,000873813 0,96 0,3643 X4X6 0,00382704 1 0,00382704 4,22 0,0858 X5X5 0,413573 1 0,413573 455,85 0,0000 X5X6 0,0452395 1 0,0452395 49,86 0,0004 X6X6 0,428437 1 0,428437 472,23 0,0000 Block 0,00147624 2 0,000738121 0,81 0,4868 Residual 0,0436594 35 0,00124741 Lack-of-fit 0,0367397 27 0,00136073 1,50 0,3230 Pure error 0,00544353 6 0,000907254 Total (corr.) 1,06012 44 R2 0,9602 Adj R2 0,9499
Kết quả phân tích thống kê ANOVA (Bảng 4.8) cho thấy mơ hình tương quan có ý nghĩa thống kê cao, giá trị cho hệ số R2 bằng 0,96. Ý nghĩa của mỗi hệ số được xác định thông qua kiểm định F và giá trị p. Kết quả Bảng 4.8 đã cho thấy giá trị F và p của mơ hình
lần lượt là 90,54 và 0,00; điều đó có nghĩa là mơ hình đã được chấp nhận. Từ các số liệu thu thập được, mơ hình tương quan giữa hàm lượng puerarin tổng hợp được từ q trình chuyển hóa giữa các gốc đường maltose, glucose và phân tử puerarin và các nhân tố khảo sát (nhiệt độ, thời gian, nồng độ) đã được xây dựng và thể hiện ở phương trình 4.
Z = 1,59074 + 0,129549X4 + 0,32109X5 + 0,197767X6 – 0,00116001X42 – 0,000426667X4X5 + 0,000357167X4X6 – 0,0483066X52 + 0,00614X5X6 –
0,00786672X62 (4)
Trong đó: Z: puerarin (mg/g)
Các hệ số trong mơ hình bao gồm hệ số bậc một, hệ số bậc hai, hệ số tương tác đều có ý nghĩa (p<0,05), trong đó các hệ số khơng có ý nghĩa có thể được lược bỏ nhằm rút gọn phương trình. Phương trình (4) trở thành:
Z = 1,38994 + 0,133199X4 + 0,217411X6 + 0,297624X5 – 0,00116001X42 – 0,00786672X62
– 0,0483066X52 + 0,00614X5X6 (5)
Trong mơ hình này các hệ số tương tác giữa nhiệt độ-thời gian, nhiệt độ-nồng độ đã được lược bỏ. Hệ số tuyến tính thời gian (p = 0,32>0,05) tuy khơng có ý nghĩa nhưng vẫn được giữ trong mơ hình nhằm đảm bào tính hệ thống của mơ hình. Bên cạnh đó,
kiểm tra độ phù hợp của mơ hình thơng qua kiểm tra Lack of fit (p = 0,32) khơng có ý nghĩa thống kê càng khẳng định khả năng phù hợp của mơ hình là rất cao.
Phương trình (6) được thiết lập để diễn tả sự tương thích giữa hàm lượng puerarin tổng hợp được theo thực nghiệm và hàm lượng puerarin theo mơ hình. Hệ số R2 bằng 0,9895 càng khẳng định dữ liệu dự đốn theo mơ hình và thực nghiệm có độ tương thích cao.
y = 0,9895 x + 0,0756 (6)
Hình 4.9: Biểu đồ thể hiện sự tương thích giữa hàm lượng puerarin theo thực nghiệm và theo mơ hình
Hình 4.10: Đồ thị sắc ký phân tích hàm lượng puerarin. (A) puerarin chuẩn (thời gian lưu 3,22 phút), (B) puerarin trong dịch thủy phân (thời gian lưu 3,23 phút)
Phân tích HPLC để xác định hàm lượng puerarin tổng hợp được với thời gian lưu của peurarin chuẩn và puerarin trong mẫu tương ứng được xác định là 3,22 phút và 3,23 phút.
(A)
(B)
(C)
Hình 4.11: Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn ảnh hưởng của một số yếu tố đến q trình biến tính hợp chất puerarin dưới tác dụng của enzyme BSMA (mg/g)
A: ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ (ở nồng độ 15U/g bột) B: ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ (ở thời gian 4 giờ) C: ảnh hưởng của thời gian và nồng độ (ở nhiệt độ 55oC)
Để xem xét sự tương tác của các nhân tố ảnh hưởng, các đồ thị 3 chiều của mơ hình hồi quy khơng tuyến tính được trình bày ở Hình 4.11. Hình biểu diễn cho thấy cả
3 nhân tố (nhiệt độ, thời gian, nồng độ enzyme) cũng như sự tương tác của các cặp nhân tố (nhiệt độ-thời gian, thời gian-nồng độ, nhiệt độ-nồng độ) đều có ảnh hưởng đến hàm lượng puerarin tổng hợp được. Khi nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme tăng từ 45oC, 2 giờ và 10 U/g bột, tương ứng, đến giá trị tối ưu, thì hàm lượng puerarin tổng hợp được cũng tăng theo. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng ngồi giá trị tối ưu thì puerarin lại có chiều hướng giảm.
Các phản ứng chuyển hóa được biết đến để biến đổi một số đặc tính của các chất như glycoside. Có rất nhiều sản phẩm chuyển hóa được tạo thành giữa chất cho và nhiều loại chất nhận khác nhau bằng việc sử dụng enzyme riêng biệt để thực hiện các phản ứng chuyển hóa. Tính đặc hiệu của q trình chuyển hóa phụ thuộc vào loại enzyme, cấu hình của liên kết glycoside được tạo thành giữa phân tử chất cho và chất nhận (Park et al., 2012). Các phương pháp chuyển hóa dùng enzyme có nhiều thuận lợi hơn so với phương pháp hóa học trong việc tổng hợp các oligosaccharides và dẫn xuất của chúng như các bước phản ứng ít hơn, quy trình tinh chế đơn giản hơn và năng suất cao hơn (Park et al., 2012). Enzyme BSMA không những chuyển các mono và disaccharides mà cịn có khả năng chuyển nhiều hợp chất có cấu trúc khác nhau như hợp chất đường rượu, flavonoids (Lee et
al., 1999) và acid ascorbic (Bae et al., 2002). Nhiều phân tử sinh học quan trọng có thể bị
biến tính bằng phản ứng chuyển hóa dẫn đến các tính chất của chúng cũng thay đổi theo (Lee et al., 1999; Cho et al., 2000 ; Meulenbeld & Hartmans, 2000; Bae et al., 2002; Baek
et al., 2003).
Cơ chế phản ứng của enzyme BSMA được Homa Torabizadeh & Ensieh Montazeri (2020) trình bày như sau: enzyme maltogenic amylase có khả năng cắt các liên kết trong phân tử amylose và amylopectin. Đối với amylose, BSMA có tác dụng cắt liên kết α-1,4 hiệu quả tạo thành các mạch oligosaccharide ngắn hơn bao gồm từ 2 đến 10 phân tử đường đơn liên kết với nhau. Đối với amylopectin, BSMA có tác dụng cắt liên kết α-1,4 tốt hơn so với liên kết α-1,6 tạo thành sản phẩm là các bó amylopectin có độ phân nhánh cao. Vì vậy, với nồng độ cơ chất sử dụng thấp, quá trình thủy phân tạo thành sản phẩm là các phân tử maltose vì vậy enzyme này có tên là “maltogenic amylase”. So sánh với CGTases hoạt tính chuyển glycoside của maltogenic amylase yếu hơn nhiều bởi vì maltogenic amylase chủ yếu chuyển cơ chất thành các sản phẩm thủy phân.
Choi et al., 2010 đã ứng dụng hoạt tính chuyển hóa của BSMA để cải thiện độ hòa tan của puerarin với cơ chất sử dụng là maltodextrin. Kết quả phản ứng chuyển hóa puerarin sử dụng BSMA thơ tạo ra sản phẩm với tỷ lệ lượng tương đối của các chất maltosyl-α-(1-6)- puerarin, glucosyl-α-(1-6)-puerarin, glucosyl-α-(1-3)-puerarin và puerarin được xác định tương ứng là 26:18:7:49. Trải qua quá trình tinh sạch 2 bước, thu được 1,7 g các sản phẩm chuyển hóa của puerarin từ 3 g puerarin. Park et al. (2012) cũng đã nghiên cứu quá trình biến đổi sinh học của hợp chất isoflavone bằng hoạt tính chuyển hóa của enzyme MAase. Các MAase khơng chỉ xúc tác q trình thủy phân cơ chất mà còn thực hiện phản ứng chuyển đổi các phân tử chất nhận khác nhau bằng cách
tạo thành liên kết α-(1,6)-glycoside. Hai sản phẩm chính của q trình chuyển hóa lần lượt là các chất glucosyl-α-(1,6)-puerarin và maltosyl-α-(1,6)-puerarin. Sử dụng enzyme chuyển hóa BSMA khơng những cải thiện độ hịa tan trong nước của puerarin mà cịn duy trì đầy đủ hoạt tính chống oxy hóa và hạ cholesterol máu của puerarin (Li et al., 2004; Chung et al., 2008).
Kết quả phân tích cho thấy ở nhiệt độ 55°C, thời gian 4 giờ và nồng độ enzyme BSMA 15 U/g bột, hàm lượng puerarin tổng hợp được là cao nhất (dao động từ 7,4762 mg/g đến 7,4976 mg/g). Từ kết quả thu được từ mơ hình, điều kiện tối ưu của q trình chuyển hóa cũng đã được xác lập như sau: nhiệt độ 57,48°C, thời gian 4,05 giờ và nồng độ enzyme 15,46 U/g tinh bột. Khi tiến hành thủy phân bột sắn dây với điều kiện tối ưu dưới tác dụng của enzyme β-amylase và BSMA, hàm lượng puerarin tổng hợp được là 7,51±0,02 mg/g, kết quả này khơng khác biệt có ý nghĩa so với kết quả dự đốn từ mơ hình (7,49 mg/g) ở độ tin cậy 95%.
Phương pháp bề mặt đáp ứng theo mơ hình Box-Behnken được áp dụng để tối ưu hóa q trình thủy phân tinh bột sắn dây cũng như q trình biến tính hợp chất puerarin để cải thiện độ hịa tan trong nước của puerarin. Q trình thủy phân bột sắn dây dưới tác dụng của β-amylase ở điều kiện tối ưu 54,34oC, nồng độ enzyme 41,46 U/g bột với thời gian 4,24 giờ thì hàm lượng đường khử thu được là cao nhất 161,07±2,96 mg/g. Hàm lượng puerarin tổng hợp được khi phân tích sắc ký lỏng cao áp là 7,5085±0,02 mg/g ở điều kiện tối ưu như sau: 57,47 oC; 4,05 giờ; BSMA 15,45 U/g bột.
4.4. Quy trình biến tính hợp chất puerarin đề nghị
Ch
Thuyết minh quy trình
Sắn dây tươi sau khi mua về được gọt vỏ, rửa sạch, cắt lát mỏng, sấy khô đến khối lượng không đổi ở 70°C.
Nghiền: sắn dây sau khi sấy khô được đem đi nghiền mịn, bảo quản trong tủ mát và được sử dụng xun suốt trong q trình thí nghiệm. Q trình nghiền nhằm mục đích đồng nhất nguyên liệu, tạo điều thuận lợi cho các cơng đoạn tiếp theo.
Hồ hóa: nhằm phá vỡ màng tế bào của tinh bột sắn dây, giúp cho tinh bột hòa tan trong nước dễ dàng, tạo điều kiện thuận lợi cho q trình thủy phân. Q trình hồ hóa được thực hiện ở nồng độ cơ chất 10%, nhiệt độ 90°C trong thời gian 30 phút.
Đường hóa: nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho q trình chuyển hóa tinh bột thành đường (maltose và các dextrin). Giai đoạn này được thực hiện dưới tác dụng của enzyme β- amylase. Các điều kiện tối ưu về nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme tương ứng: 54,34°C, 4,24 giờ, 41,46 U/g bột sắn dây.
Xử lý BSMA: dung dịch sắn dây trong giai đoạn đường hóa sẽ tạo ra đường maltose và các dextrin. Vì vậy, việc bổ sung enzyme BSMA trong giai đoạn này nhằm thủy phân các đường trên thành các đường glucose, maltose đồng thời gắn các gốc đường này vào các đường maltose-oligosaccharide khác theo liên kết 1-6 glycoside giúp tạo thành đường IMO cũng như làm thay đổi cấu trúc puerarin từ dạng không tan thành dạng tan trong nước.
uẩn bị nguyên liệu
Hoạt độ
pH (Thơng tin xử lý)
Trong q trình xử lý BSMA bổ sung 10% maltodextrin sử dụng dung dịch đệm natri citrate (pH 6) để tăng hoạt tính của enzyme.
Q trình biến tính được thực hiện dưới điều kiện tối ưu: nhiệt độ 57,47°C, thời gian 4,05 giờ và nồng độ enzyme 15,45 U/g bột sắn dây.
Sau mỗi q trình xử lý enzyme đều có cơng đoạn vơ hoạt enzyme để khơng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme sau đó.
4.5. Tối ưu hóa q trình lên men nước dứa có bổ sung phức chất puerarin- maltose maltose
4.5.1. Sự sinh trưởng và phát triển của giống Saccharomyces oviformis trong môi trường nước dứa-sắn dây ở giai đoạn nhân sinh khối
Hình 4.13: Tổng số tế bào nấm men thu được tương ứng với các tỷ lệ phối trộn nước dứa ‒ sắn dây
Ghi chú: *Sự khác biệt không ý nghĩa trong tổng số tế bào nấm men sau 1 ngày (p > 0,05) a2-c2sự khác biệt có ý nghĩa sau xử lý thống kê trong tổng số tế bào nấm men sau 2 ngày (p < 0,05) a3-c3sự khác biệt có ý nghĩa sau xử lý thống kê trong tổng số tế bào nấm men sau 3 ngày (p < 0,05)
Kết quả phân tích ANOVA (phụ lục B1) cho thấy ảnh hưởng có ý nghĩa của tỷ lệ nước dứa/sắn dây đến số lượng tế bào thu được trên 1 mL mẫu (Hình 4.13). Theo dõi sự tăng sinh tế bào nấm men sau 1 ‒ 2 ‒ 3 ngày, kết quả cho thấy ở các mẫu khảo sát ứng với ngày 1, tổng số tế bào nấm men thu được dao động từ 400 < x < 450 triệu tế bào/mL và có sự khác biệt khơng ý nghĩa giữa những mẫu này. Trong khi đó, ở các mẫu khảo sát ứng với ngày 2 và 3, tổng số tế bào nấm men thu được dao động đáng kể (p < 0,05) so với ngày đầu khảo sát. Mật số tế bào tăng sinh đạt cực đại sau 48 giờ tại mẫu phối trộn 6 ‒ 4 (630±21,2 triệu tb/mL) và 8 ‒ 2 (594±12,7 triệu tb/mL). Phân tích LSD cho thấy, xu hướng tăng sinh của nấm men trong môi trường trong suốt q trình ni cấy 3 ngày là tương tự nhau. Cụ thể, có sự khác biệt khơng có ý nghĩa giữa các mẫu tương
BrixpHCồn
Ngày 1 BrixpHNgày 2 Cồn BrixpHNgày 3 Cồn
ứng với các tỷ lệ nước dứa/sắn dây 2 ‒ 8 và 4 ‒ 6 (ngày 1), 6 ‒ 4 và 8 ‒ 2 (ngày 1). Trước 36 giờ sau ni cấy, nấm men trong giai đoạn thích nghi với mơi trường, số lượng tế bào tăng không đáng kể và khơng có sự khác biệt giữa các mẫu khảo sát. Từ 36 ‒ 48 giờ là giai đoạn logarit, thời điểm số lượng tế bào nấm men tăng theo cấp số nhân và đạt giá trị cực đại ở khoảng 48 giờ. Trong gia đoạn các tế bào phát triển ào ạt, các chất dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt dần, đồng thời trong mơi trường xuất hiện và tích tụ các sản phẩm trao đổi chất không cần thiết đối với tế bào, do đó, làm mất đi điều kiện thuận lợi cho sinh trưởng của tế bào, quần thể nấm già cỗi, thối hóa và xảy ra hiện tượng tự phân, sinh khối tế bào giảm (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2004).
Sự thay đổi tính chất hóa lý gồm tổng chất rắn hịa tan, pH và nồng độ cồn của các mẫu dịch nước dứa-sắn dây trong quá trình nhân giống nấm men được trình bày ở Hình 4.16. Kết quả phân tích cho thấy giá trị pH của dịch nhân giống ở các tỷ lệ phối chế sau 3 ngày nhân giống khơng có sự thay đổi đáng kể (3,7 ‒ 3,9). Trong khi đó, tổng chất rắn hịa tan của các mẫu có sự biến đổi giảm rõ đến ngày thứ 2 và giảm chậm đến ngày thứ
3. Nồng độ cồn sinh ra có mối liên hệ tỷ lệ thuận với mật số tế bào nấm men nuôi cấy. Trong khoảng thời gian nhân giống 48 giờ, nồng độ cồn sinh ra tăng có ý nghĩa ở các mẫu qua các ngày 1, ngày 2 và ngày 3. Điển hình, nhận thấy rằng nồng độ cồn cao tại ngày 3 có giá trị dao động trong khoảng 6,14 ‒ 6,27 và có sự chênh lệch đáng kể giữa mẫu khảo sát, độ cồn cao nhất được ghi nhận ở mẫu 6 ‒ 4 (đạt 6,61±0,10) và không khác biệt với mẫu 8 ‒ 2 (đạt 6,67±0,39). Chỉ tiêu này được ghi nhận để đánh giá quá trình lên men bị ảnh hưởng bởi tỷ lệ phối trộn, sự phối trộn.
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 2-8 4-6 5-5 6-4 8-2
Hình 4.14: Sự thay đổi tổng chất rắn hịa tan, pH và nồng độ cồn trong q trình nhân giống ảnh hưởng bởi tỷ lệ phối trộn
5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 ,00 a1 b1 c1 d1 a2 a2 b2 b2 a2 b3 c3a3 b3 a3 a1 Màu sắc, độ trong 2D:8S2,222 4D:6S2,889 5D:5S3,296 6D:4S4,333 8D:2S2,148 Mùi 3,111 3,222 3,889 4,222 2,741 Vị 2,630 3,185 3,556 4,074 2,407
4.5.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ phối chế nước dứa-nước sắn dây đến giá trị cảmquan của sản phẩm quan của sản phẩm
Bộ dữ liệu được ghi nhận dựa trên sự đánh giá của hội đồng đánh giá bao gồm 30 thành viên, được hướng dẫn, độ tuổi từ 20 đến 30, là sinh viên năm 2 Trường Đại học Tiền Giang, nhân viên văn phòng tại tỉnh Tiền Giang.
Nhân tố cảm quan
Hình 4.15: Điểm cảm quan của các mẫu nước dứa-sắn dây ứng với các tỷ lệ phối trộn khác nhau
(a-d sự khác biệt trong các mẫu, 1-3 phân biệt chỉ số cảm quan)
Điểm cảm quan của các mẫu nước dứa-sắn dây ứng với các tỷ lệ phối trộn khác nhau được trình bày ở Hình 4.15. Kết quả cho thấy các mẫu 2D : 8S, 4D : 6S, 5D : 5S và 6D : 4S có sự khác biệt có ý nghĩa chỉ tiêu về màu sắc, độ trong. Tuy nhiên, sự khác biệt không ý nghĩa giữa mẫu 2D : 8S và mẫu 8D : 2S đối với 3 chỉ tiêu đánh giá. Thống kê ANOVA (p < 0,05) cho giá trị khơng có sự khác biệt về mùi giữa 3 mẫu 2D : 8S, 4D
: 6S và 8D : 2S, cả 3 đạt mức điểm thấp khoảng 3 ‒ 3,5 trên thang 6 điểm. Bảng 4.9: Kết quả đánh giá cảm quan mẫu tỷ lệ phối trộn có trọng số