M Ở ĐẦ U
1.1.4.3. Hoạt tính chống viêm
Các hợp chất tritecpen 5 vòng ñược phân bố rộng rãi trong các loài thực vật, rất nhiều hợp chất ñã ñược sử dụng làm thuốc kháng viêm trong dân gian. Dạng và cách thức kháng viêm của tritecpen 5 vòng cũng ñã ñược nghiên cứu chi tiết [50].
Một hợp chất tritecpen mới 2α,3β,23-trihydroxyolean-12-en ñã ñược thử nghiệm bằng ñường uống trên chuột, kết quả cho thấy có hoạt tính kháng viêm và giảm ñau. Với cùng một liều lượng 100 mg/kg thì khả năng giảm ñau trên chuột của tritecpen này là 37% trong khi ñó aspirin là 85% [16].
Các hợp chất taraxasterol axetat, moretenol acetate, moretenol và neu- lupanol cũng ñược phát hiện có hoạt tính kháng viêm mạnh [52].
Hay 4 chất ñược phân lập từ hạt của loài Vitex negundo (Verbenaceae):
Axit 3β-acetoxyolean-12-en-27-oic; axit 2α, 3α-dihydroxyolean-5,12-dien-28- oic; axit 2β, 3α-diacetoxy-olean-dien-28-oic và axit 2α, 3β-diacetoxy-18-hyd- -roxyolean-5,12-dien-28-oic cũng thể hiện hoạt tính kháng viêm khá mạnh [51].
1.1.5. Một số nghiên cứu về tổng hợp các dẫn xuất của các tritecpen
Trong những năm gần ñây ñã có rất nhiều nghiên cứu về các hoạt tính sinh học như khả năng kháng viêm, kháng vi rút, kháng HIV và chống ung thư của các tritecpen khung lupan. Trong quá trình sàng lọc các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học người ta ñã phát hiện thấy axit betulinic (16), một hợp chất tách ra từ các loài thuộc chi Betula, họ Betulaceae, có hoạt tính ức chế chọn lọc ñối với tế bào ung thư hắc tố da hoặc ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thưở người [49].
Tồn tại rộng rãi trong tự nhiên với hàm lượng khá cao, và có nhiều hoạt tính thú vị, nhiều dẫn xuất mới của axit betulinic có hoạt tính lý thú hơn ñã
cacbonyl ở C-28 của axit betulinic tạo thành dãy các dẫn xuất mới có hoạt tính sinh học lý thú hơn. Ví dụ, hợp chất 47 và 48 thể hiện hoạt tính kháng HIV ức chế NL4-3 trong dòng tế bào MT-4 với các giá trị EC50= 0,01µmol/L (IC50=12,2 µmol/L) và EC50= 0,007µmol/L (IC50=11 µmol/L) [12]. Các sản phẩm từ phản ứng este hóa và amit hóa nhóm hydroxyl cùng nhóm cacboxyl của axit betulinic ñều có hoạt tính sinh học cao hơn so với axit betulinic, như
dẫn xuất mới 49 và 50 ñều cho thấy khả năng ức chế mạnh sự sinh trưởng của vi rút HIV với các nồng ñộ tác dụng EC50= 0,0047µmol/L (IC50>10 µmol/L) và EC50= 0,0026µmol/L (IC50=8 µmol/L) [38]. Đặc biệt, trong các dẫn xuất mới của axit betulinic 51, có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của vi rút HIV và hiện tại ñang trong tiến trình thử nghiệm lâm sàng giai ñoạn 2b [12].
R = CH3: Axit betulinic 16
R= Cl: Axit 2-chloro-3-oxo-lup-1,20(29)-dien-28-oic 52 R= CHO: Axit metyl 2-formyl-3-oxo-lup-1,20(29)-dien-28-oic 53
Những biến ñổi hóa học trong vòng A của axit betulinic tạo hệ liên hợp 2-chloro- hay 2-formyl-3-oxo-1-en như các dẫn xuất axit 2-chloro-3-oxo-lup-
1,20(29)-dien-28-oic (52)và axit metyl 2-formyl-3-oxo-lup-1,20(29)-dien-28- oic (53), có hoạt tính ñộc tế bào khá mạnh ñối với 3 dòng tế bào ung thư gồm A-549, B16 và SK-MEL-2, ñặc biệt là hợp chất 52 có hoạt tính mạnh tăng gấp 59 lần so với axit betulinic trên tế bào ung thư hắc tố da SK-MEL-2 [66].
Trong quá trình nghiên cứu các dẫn xuất của axit 23-hydroxy betulinic
(AHB) (46) [63], Yi Bi và cộng sự thông báo ñã tổng hợp ñược một dãy dẫn xuất este 54, 55, 56, 57, 58 và 59 ở vị trí C-28 có hoạt tính cao hơn chất ñầu AHB ñối với cả 5 dòng tế bào ung thư gồm ung thư phổi A-549, ung thư hắc tố da B16, ung thư não SF-763, ung thư gan BEL-7402 và ung thư thần kinh chuột C6, ñặc biệt hợp chất 54 có khả năng ức chế tế bào ung thư gan H22 ở
chuột tương tự với cyclophosphamide và cao hơn nhiều so với AHB.
Axit oleanolic (60) tồn tại với hàm lượng khá cao ở loài Sambucus chinensis và ñược tìm thấy trong hơn 120 loài thực vật khác. Do có nhiều hoạt tính thú vị khác nhau như hoạt tính kháng viêm, kháng nấm, hay hoạt tính gây
ñộc tế bào ñối với nhiều dòng tế bào khác nhau như: A549, SK-OV-3, SK- MEL-3, HCT 15, HONE-1 và KB… nên nhiều dẫn xuất của nó có hoạt tính lý thú ñã ñược tổng hợp [47].
Axit oleanolic 60
Theo báo cáo của nhóm nhà khoa học người Trung Quốc, từ axit oleanolic ñã tổng hợp ñược chất 61 có hoạt tính kìm hãm sự phát triển của enzim phosphorylaza GPa mạnh gấp 4 lần so với axit oleanolic với giá trị IC50
= 3.3 µM [33].
Axit clo oleanolic 61
Nhóm tác giả Young-Ming Zhu và cộng sự ñã tổng hợp 13 dẫn xuất và
ñánh giá hoạt tính kháng HIV của chúng. Kết quả chỉ ra rằng, các dẫn xuất
este 62, 63, 64 và các amit 65, 66 của axit oleanolic thể hiện hoạt tính kháng HIV với EC50=0.1 µg/ml, trong ñó chất 64 ñược chứng minh là chất có hoạt tính mạnh nhất với giá trị EC50=0.0039 µg/ml [65].
Năm 2005, Yuan Zhang và cộng sự ñã bán tổng hợp 14 dẫn xuất amit của axit oleanolic, trong ñó 2 dẫn xuất 67, 68 thể hiện hoạt tính chống lại sự
R = -HNCH(CH2C6H5)COOH 67
R = -HN(-CH2-CH2-CH2-)CHCOOH 68
Năm 2009, Jun-Feng Li và cộng sự ñã tổng hợp ñược dãy các dẫn xuất của axit oleanolic bao gồm các amid, indole, pyrazine, quinoxaline, quinoline. Kết quả cho thấy có 2 chất 69 và 70 có hoạt tính chống lại dòng tế bào hủy xương khá mạnh, ngay cả ở nồng ñộ 200 nM [34].
Với sự biến ñổi hóa học trên vòng A của axit 18β-glycyrrhetic, nhóm tác giả Đài Loan ñã bán tổng hợp ñược 3 dẫn xuất 71, 72, 73 có hoạt tính chống oxi hóa và kháng viêm [13].
Oleanolic indole amit 70
Oleanolic xetoesste 71
R = O-CH2-Ph 72 R = NHCH(CH3)2 73
1.2. TỔNG QUAN VỀ AXIT URSOLIC VÀ CÁC DẪN XUẤT CỦA NÓ 1.2.1. Axit ursolic
Axit ursolic ( axit 3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic, AU) (74) còn ñược gọi là urson, prunol, micromerol..., là một tritecpen không ñộc, chất rắn dạng bột, màu trắng, có công thức phân tử là C30H48O3 và có thể kết tinh trong cồn tuyệt
như táo, húng quế, bạc hà, oải hương, mận...[43], [68].
Axit ursolic 74
Các nghiên cứu dược lý ñã chỉ ra rằng axit ursolic thể hiện phổ hoạt tính ña dạng như: kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm nhiễm, bảo vệ gan, chống lại các tế bào ung thư và khối u... Axit ursolic có khả năng ngăn chặn và ức chế sự tạo u ung thư ở các giai ñoạn khác nhau của nhiều loại ung thư
như vú, gan, ruột. Nhóm nhà khoa học Nhật Bản ñã tìm ra hoạt tính chống khối u của axit ursolic tách từ cây Glechoma hederacea, cụ thể là nó ức chế
sự hoạt hóa của vi rút Epstein-Barr trong dòng tế bào Raji gây ra bởi chất 12- O-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) [30], [52].
Sự phân tách ñịnh hướng sinh học-hoạt tính ñộc với tế bào bạch cầu của dịch chiết của các loài Prunella vulgaris, Psychotria serpens và Hyptis capitata ñã dẫn tới việc phân lập axit ursolic như là một chất có tác dụng chính [52]. Axit ursolic tỏ ra rất ñộc với tế bào khối u phổi dạng A-549, cũng như với tế bào bạch cầu lympho P-388 và L-1210 và khả năng ức chế phát triển khối u B16 trên da chuột [11], [30], [61].
Hiện nay, nó ñược sử dụng trong thuốc mỡ ñểñiều trị bỏng, và là thành phần chính trong mỹ phẩm ñể phòng ngừa và chống lại bệnh ung thư da tại Nhật Bản [30].
hoạt tính lý thú nên axit ursolic ñược sử dụng làm nguyên liệu ñầu ñể tổng hợp nhiều dẫn xuất có hoạt tính mới và mạnh hơn.
1.2.2. Một số nghiên cứu về tổng hợp các dẫn xuất của axit ursolic
Tồn tại rộng rãi trong tự nhiên với hàm lượng khá cao, và có nhiều hoạt tính thú vị, nhiều dẫn xuất mới của axit ursolic có hoạt tính lý thú hơn ñã
ñược tổng hợp. Sự chuyển hóa các nhóm chức hydroxyl ở C-3 và nhóm cacboxyl ở C-17 của axit ursolic tạo thành dãy các dẫn xuất mới có hoạt tính sinh học lý thú hơn.
Nhóm nhà khoa học người Trung Quốc [8] ñã tổng hợp và nghiên cứu hoạt tính của một dãy các dẫn xuất 3-O-este của axit ursolic. Kết quả thử hoạt tính chỉ ra rằng, các hợp chất axit 3-O-palmitoyl ursolic (75), axit 3-O- crotonyl ursolic (76) và axit 3-O-propionyl ursolic (77) có tác dụng kìm hãm sự phát triển dòng tế bào ung thư gan PLC/RPF/5 ở người khá mạnh với giá trị EC50 là 3.54, 2.59 và 2.54 µg/ml.
Các sản phẩm từ phản ứng axetyl hóa của nhóm hydroxyl và amit hóa nhóm cacboxylic của axit ursolic ñều có hoạt tính sinh học cao hơn so với axit ursolic, như dẫn xuất mới 78, 79, và 80 ñều cho thấy khả năng ức chế mạnh sự sinh trưởng của dòng tế bào HeLa với các nồng ñộ tác dụng IC50= 10.83µM, 5.44 µM và 1.63 µM [26].
Hai hợp chất este hóa 81, 82 với nhóm isopropyl ở C17-COOH và nhóm succinyl ở C3-OH của axit ursolic cũng thể hiện hoạt tính ñộc tế bào khá mạnh ñối với dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt NTUB1 ở người với các giá trị IC50 là 7.97 µM và 8.65 µM [62].
Những biến ñổi hóa học ở vòng A của axit ursolic tạo hệ liên hợp 1-en- 2-cyano-3-one hay 1-en-2-trifluoro-3-one trong các dẫn xuất 83, 84 ñều cho thấy khả năng ức chế khá mạnh sự sinh trưởng của 4 dòng tế bào ung thư: KU7, 253JB-V (ung thư bàng quang) và Panc-1 và Panc-28 (ung thư tuyến tụy) [18]. Hay dẫn xuất mới 5β-(1-methyl-2-ethyl)-10α-(3-aminopropy-l)des-
ung thư tuyến tiền liệt NRP.152 với nồng ñộ ức chế là IC50=3.3µM [22]. Sự
biến ñổi hóa học kết hợp trên cả vòng A và vòng C của axit ursolic tạo hợp chất bis-enone 86 có khả năng ức chế sự hình thành nitric oxit (NO) với nồng
ñộức chế tương ứng IC50=5.1 µM [55].
5β-(1-methyl-2-ethyl)-10α-(3-aminopropy-l)des-A-urs-12-en-28-oic acid 85
CHƯƠNG 2
THỰC NGHIỆM
Trong quá trình làm thực nghiệm, chúng tôi ñã theo dõi tìm các ñiều kiện phản ứng thích hợp và kiểm tra ñộ tinh khiết của sản phẩm trên sắc ký lớp mỏng (SKLM) và tách chất trên sắc ký cột. Cấu trúc hóa học của axit ursolic và các sản phẩm tạo thành ñược xác ñịnh bằng các phương pháp phổ
như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H, 13C-NMR), phổ khối (ESI-MS).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ñược ghi trên máy Bruker Avance 500MHz, phổ khối ESI-MS ñược ño trên máy HP 5989B-MS tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. FT-IR: Nicolet IMPACT 410. Sắc ký bản mỏng ñược tiến hành trên bản silicagel Merck 60F254. Sắc ký cột sử dụng silicagel cỡ hạt 0,04-0,063 mm.
Các hóa chất và dung môi làm phản ứng cũng như chạy cột ñều là dạng tinh khiết, của hãng Merck hoặc qua chưng cất.
2.1. CHIẾT TÁCH AXIT URSOLIC
* Mẫu thực vật
Cây Sơn Trà Poilan (Eriobotrya poilanei J. E. Vid) ở Việt Nam thuộc họ hoa hồng (Rosaceae) là cây ñại mộc cao ñến 15 m. Lá dài 15-18 cm, bìa có răng cong, không lông, gân phụ 10-12 cặp. Chùm tụ tán ngắn hơn 5 cm, có lông hoe, ñài cao 5 mm. Cánh hoa không lông; tiểu nhụy vào 30, vòi nhụy 4 (3-5). Trái tròn, to 15 mm.
Phân bốở ven rừng, vùng núi, cao ñộ 1200 - 1500 m- Lâm Đồng [1]. Mẫu lá cây Sơn Trà Poilan ñược thu hái tại rừng quốc gia Bì Dúp, Núi Bà thuộc tỉnh Lâm Đồng vào tháng 3 năm 2009 và do TS. Đỗ Tiến Hiệp – Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác ñịnh tên khoa học.
*Chiết mẫu thực vật và phân lập axit ursolic
Mẫu lá (1800g) ñược sấy khô, nghiền nhỏ và ngâm chiết 3 lần trong hỗn hợp metanol:nước (85:15) ở nhiệt ñộ phòng. Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất giảm, dịch nước còn lại ñược chiết lần lượt với các dung môi n- hexan, etyl axetat, n-butanol. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu ñược các cặn dịch chiết tương ứng với khối lượng là 12, 110 và 130g.
50 g dịch chiết EtOAc ñược ñưa lên cột silicagel, giải hấp bằng hỗn hợp n-hexan: EtOAc với tỉ lệ EtOAc tăng từ 50 ñến 100%, sau ñó bằng hỗn hợp EtOAc:MeOH với tỉ lệ MeOH tăng từ 0 ñến 50% thu ñược 20 phân ñoạn. Các phân ñoạn 1- 10 xuất hiện kết tủa bột màu trắng, chúng tôi ñã lọc hút, lấy phần chất rắn và rửa nhiều lần với n-hexan, thu ñược 11.7g bột, ký hiệu là EPE1, cho một vệt trong bản mỏng phân tích, nhưng là một hỗn hợp chứa 2 chất chính trong phổ1
H-NMR. Vì vậy ñể tăng khả năng phân tách của hỗn hợp này chúng tôi ñã tiến hành phản ứng axetyl hóa EPE1.
Tinh chế sản phẩm axetyl hóa bằng cột silicagel với hệ dung môi n- hexan: EtOAc = 92:8 thu ñược hai chất axit 3β-axetyl ursolic và axit 3β- acetyl pomolic. Thủy phân sản phẩm axit 3β-acetyl ursolic với NaOH 4N thu
ñựợc 5.8 g axit ursolic (hàm lượng 0.32% so với mẫu khô) (Hình 2.1).
2.2. TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT Ở VỊ TRÍ C3-OH CỦA AXIT URSOLIC. URSOLIC.
2.2.1. Tổng hợp chất axit 3-oxo-urs-12-en-28-oic 87
100 mg CrO3 ( 1 mmol ) hòa trong 10 ml H2SO4 30% ñược nhỏ dần vào hỗn hợp 46 mg axit ursolic ( 0,1 mmol) hòa tan trong 10 ml axetone. Hỗn hợp phản ứng ñược khuấy ở nhiệt ñộ phòng 1 giờ. Cất loại dung môi hữu cơ dưới áp suất giảm rồi chiết bằng EtOAc (50 ml), pha hữu cơ rửa 2 lần với nước cất (20 ml + 20 ml) rồi cất loại dưới áp suất giảm thu ñược chất rắn, ñem tách
trên cột silicagel với hệ dung môi n-hexan: EtOAc= 7:1 thu ñược 30 mg chất
87. Hiệu suất: 65 %.
Hình 2.1: Sơñồ chiết, tách axit ursolic từ lá cây Sơn Trà Poilan
Lá cây E. poilanei
(1,8 kg)
1. Thêm 250ml H2O
2. Chiết phân lớp lần lượt với n-hexan, EtOAc và n-butanol
1. Phơi khô, nghiền nhỏ
2. Ngâm chiết trong MeOH : H2O (85:15) ở to phòng
3. Cất quay chân không, loại metanol
Dịch H2O Dịch n-hexan Dịch EtOAc Dịch H 2O còn lại Dịch BuOH Cặn EtOAc (50g) Cất loại dung môi SKC silicagel n-Hexan:
EtOAc,lượng EtOAc 50-100% và EtOAc:MeOH, lượng MeOH 0 - 50% Phân ñoạn 1- 10 Phân ñoạn 11 Phân ñoạn 20 1. Lọc, hút chất rắn 2. Thực hiện phản ứng acetyl hóa hỗn hợp chất rắn thu ñược
3. Thủy phân axit 3β-acetyl ursolic Axit ursolic 5.8 g (0.32% so với mẫu khô) khô) ... .
Hình 2.2: Sơñồ tổng hợp các dẫn xuất 89, 90 ở nhóm C3-OH của axit ursolic
1
H-NMR (CDCl3): δ 0.83 (3H, s, CH3), 0.86 (3H, d, J=6.5 Hz, CH3).
s, CH3), 2.19 (1H, d, J=11.5 Hz, H-18), 2.36 (1H, m, H-2a), 2.51 (1H, m, H-
2b), 5.25 (1H, m, H-12).
2.2.2. Tổng hợp chất axit 3-hydroxyimino-urs-12-en-28-oic 88
Hỗn hợp của 46 mg (0,1 mmol) chất oxo 87 và 1 ml NH2OH.HCl 40% trong nước ñược hòa tan vào 2 ml pyridine/methanol với tỉ lệ 1/1 ñược ñun 4 giờ ở 600C. Sau ñó cất loại dung môi hữu cơ dưới áp suất giảm, cặn còn lại
ñược chiết ba lần bằng EtOAc, dịch chiết ñược gộp lại rồi rửa với nước, làm khan bằng Na2SO4, lọc dịch chiết. Cất loại dung môi, ñem tách cặn thu ñược trên cột silicagel CH2Cl2: MeOH= 98: 2 thu ñược 34 mg oxim 88. Hiệu suất: 73 %. 1 H-NMR (CDCl3): δ 0.82 (3H, s, CH3), 0.88 (3H, d, J=7.0 Hz, CH3), 0.96 (3H, d, J=6.0 Hz, CH3), 1.02 (3H, s, CH3), 1.06 (3H, s, CH3), 1.07 (3H, s, CH3), 1.15 (3H, s, CH3), 2.22 (1H, d, J=11.5 Hz, H-18), 2.26 (1H, m, H- 2a), 3.04 (1H, m, H-2b), 5.26 (1H, t-like, H-12). 2.2.3. Tổng hợp axit 3-acetocyimino-urs-12-en-28-oic89
0,1 ml anhidrit axetic ñược nhỏ vào dung dịch của 30 mg oxim 88
(0,064 mmol) trong 1 ml pyridin ở nhiệt ñộ phòng. Hỗn hợp phản ứng ñược