mẫu nhiễm
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) *100
mẫu nuôi cấy mẫu chết
Tỷ lệ mẫu chết (%) *100
mẫu nuôi cấy mẫu sống
Tỷ lệ mẫu sống (%) *100
mẫu nuôi cấy số chồi Số chồi / mẫu số mẫu cấy số đốt Số đốt / mẫu số chồi số protocorm Số protocorm / mẫu số mẫu cấy
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu kỹ thuật khử trùng mẫu lan gấm
Khử trùng mẫu là giai đoạn đầu tiên trong nuơi cấy mơ tế bào thực vật, mẫu cấy được lấy từ bên ngồi tự nhiên nên dễ bị nhiễm các loại như: nấm, vi khuẩn, virus …do đĩ ngay ở giai đoạn này các mẫu cần phải đạt tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ mẫu tái sinh cao …Phương pháp khử trùng mẫu cấy thường được ấp dụng hiện nay là dùng các chất hĩa học cĩ hoạt tính diệt khuẩn do tính chất dễ thao tác, địi hỏi thiết bị đơn giản và hiệu quả cao. Các chất hĩa học thường được sử dụng như: calcium hypochlorid Ca(OCl)2, thủy ngân clorua HgCl2, hydroxid H2O2... Sử dụng chất nào, nồng độ cao hay thấp, thời gian dài hay ngắn hồn tồn phụ thuộc vào đặc điểm và tình trạng mẫu.
Với đặc điểm lan Gấm là cây thảo, mọc ở đất, cĩ thân rễ mọc dài, thân khí sinh mọng nước nên việc khử trùng tương đối khĩ. Vì vậy, trong đề tài này chúng tơi sử dụng thân khí sinh là vật liệu để khử trùng. Chất khử trùng được sử dụng là Javen và chlorin. Đây là những loại hĩa chất dễ tìm, rẻ tiền, dễ sử dụng và ít gây độc cho người thao tác.
3.1.1. Khử trùng bằng Javen
Mẫu lan gấm được tiến hành khử trùng với javen với tỷ lệ javen: nước tương ứng 1:1; 2:1 và 3: 1. Thời gian khử trùng với 5, 10, 15, 20 phút. Kết quả khử trùng được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Javen Nghiệm thức Tỉ lệ Javen:nƣớc Thời gian (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm (1tuần) Tỷ lệ mẫu chết (4tuần) Tỷ mẫu tái sinh (6tuần) NT1 1:1 5 100% 0% 0% NT2 1:1 10 100% 0% 0% NT3 1:1 15 93,33% 6,67% 0% NT4 1:1 20 66,67% 30% 3,33%
NT5 2:1 5 90% 10% 0% NT6 2:1 10 83,3% 6,67% 10% NT7 2:1 15 50% 13,33% 36,67% NT8 2:1 20 3,33% 90% 6,67% NT9 3:1 5 66,67% 16,67% 16,67% NT10 3:1 10 56,67% 20% 23,33% NT11 3:1 15 33,33% 56,67% 10% NT12 3:1 20 0% 100% 0
Qua bảng 3.1 cho thấy
Ở cùng một nồng độ Javen, khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ mẫu bị nhiễm giảm dần, tỷ lệ mẫu chết tăng dần. Tuy nhiên tỷ lệ mẫu tái sinh khơng tuân theo quy luật này. Cụ thể ở tỷ lệ 3:1 khi tăng thời gian lên 5 – 10 – 15 – 20 phút thì tỷ lệ nhiễm giảm dần từ 66,67 – 56,67 – 33,33 – 0%. Tỷ lệ mẫu chết tăng dần từ 16,67 – 20% – 56,67 – 100%. Khi tăng thời gian tử 5 – 10 phút thì tỷ lệ mẫu tái sinh tăng từ 16,67 – 23,33%, nhưng khi tăng thời gian từ 10 – 20phút thì tỷ lệ mẫu tái sinh giảm từ 23,33 xuống cịn 0%
Ở cùng thời gian khử trùng, khi tăng nồng độ chất khử trùng thì tỷ lệ mẫu bị nhiễm giảm dần. Cụ thể khi khử trùng 10 phút thì ở tỷ lệ 1:1 thì tỷ lên nhiễm 100%, ở tỷ lệ 2:1 thì tỷ lệ nhiễm giảm cịn 83,33% và đến tỷ lệ 3:1 thì tỷ lệ nhiễm cịn 56,67%
Với tỷ lệ 3:1 thời gian khử trùng là 20 phút tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất nhưng hầu như các mẫu đều chết sau 4 tuần nuơi cấy, nhưng với tỷ lệ khử trùng là 2:1 với thời gian khử trùng 15 phút thì tỷ lệ mẫu nhiễm đạt 50% và tỷ lệ tái sinh đạt cao nhất là 36,67%.
Khi khử trùng với thời gian 20 phút, các mẫu cĩ hiện tượng mềm nhũng và rã ra. Như vậy, khi dùng javen là chất khử trùng thì tỷ lệ Javen: nước là 2:1 với thời gian khử trùng thích hợp nhất là 15 phút cho tỷ lệ mẫu tái sinh cao nhất.
3.1.2. Khử trùng bằng chlorine
Mặc dù khử trùng với Javen ở tỷ lệ 2:1 trong thời gian khử trùng 15 phút cho tỷ lệ mẫu tái sinh đạt cao nhất, nhưng tỷ lệ nhiễm của mẫu chỉ đạt 50%, nên trong thí nghiệm này chúng tơi tiến hành khử trùng với chất khử trùng là Chlorine. Nồng độ và thời gian khử trùng được thể hiện qua bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hiệu quả khử trùng với chất khử trùng là Chlorine Nghiệm thức Nồng độ (%) Thời gian ( phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm (1tuần) Tỷ lệ mẫu chết (4tuần) Tỷ lệ mẫu tái sinh
(6tuần) NT13 5 5 100% 0% 0% NT14 5 10 66,67% 20% 13,33% NT15 5 15 43,3% 53,33% 3.33% NT16 10 5 66,67% 23,33% 10% NT17 10 10 46,67% 30% 23,33% NT18 10 15 0% 100% 0% NT19 15 5 83,3% 6,67% 3,33% NT20 15 10 33,3% 46,67% 20% NT21 15 15 0% 100% 0%
Qua kết quả khử trùng ở bảng 3.2 cho thấy:
- Ở cùng một nồng độ Javen, khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ mẫu bị nhiễm giảm dần, tỷ lệ mẫu chết tăng dần. Tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất 0% ở nồng độ Chlorine 10% với thời gian khử trùng là 15 phút và 15% với thời gian khử trùng 15 phút, nhưng các mẫu đều chết sau 4 tuần nuơi cấy.
- Nồng độ khử trùng càng cao và thời gian khử trùng càng kéo dài thì tỷ lệ tái sinh mẫu thấp.
- Nồng độ Chlorine 10% với thời gian khử trùng là 10 phút thì tỷ lệ mẫu tái sinh sau 6 tuần cao nhất đạt 23,33%.
Như vậy, khi sử dụng Cholorine để khử trùng lan gấm thì nồng độ thích hợp để khử trùng là 10% với thời gian khử trùng là 15 phút.
3.1.3. Khử trùng kết hợp Javen và Chlorin
Từ kết quả trên cho thấy, khi sử dụng chlorine nồng độ 10% cho tỷ lệ nhiễm thấp hơn so với dùng Javen, nhưng tỷ lệ mẫu tái sinh lại thấp hơn. Để nâng cao hiệu quả khử trùng, chúng tơi tiến hành kết hợp 2 loại chất khử trùng này để khảo sát hiệu quả khử trùng. Kết quả khảo sát được thể hiện trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Hiệu quả khử trùng với sự kết hợp Javen và Chlorine. Nghiệm thức Tỷ lệ mẫu nhiễm
(1tuần)
Tỷ lệ mẫu chết (4tuần)
Tỷ lệ mẫu tái sinh (6tuần) NT22 33,33% 16,67% 50% NT23 43,33% 46,67% 10% NT24 36,67% 43,33% 20% NT25 26,67% 50% 23,33% NT26 20% 53,33% 26,67% NT27 0% 100% 0% Từ bảng 3.3 cho thấy:
- Khi khử trùng kết hợp giữa Javen và Chlorin cho tỷ lệ nhiễm thấp ở các nghiệm thức chỉ 20% - 43,33% và tỷ lệ mẫu tái sinh tương đối cao hơn so với khi dùng chất khử trùng riêng lẻ.
- Khử trùng Javen (2:1) trong 10phút sau đĩ khử chlorine 5% trong 5 phút cho tỷ lệ mẫu tái sinh cao đạt 50% và tỷ lệ mẫu nhiễm thấp đạt 33,33% so với các nghiệm thức cịn lại.
Như vậy, hiệu quả khử trùng cao nhất khi cĩ sự kết hợp Javen (tỷ lệ 2:1) với thời gian khử trùng trong 10 phút, chlorine 5% trong 5 phút và kết quả mẫu tái sinh đạt 50%.Nhận xét:
Bảng 3.4. So sánh hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau. Nghiệm thức Tỷ lệ mẫu nhiễm (1tuần) Tỷ lệ mẫu chết (4tuần) Tỷ lệ mẫu tái sinh
(6tuần) NT7 50% 13,33% 36,67% NT17 46,67% 30% 23,33% NT22 33,33% 16,67% 50% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% NT7 NT17 NT22 Tỷlệmẫu nhiễm (1tuần) Tỷlệmẫu chết (4tuần) Tỷmẫu tái sinh (4tuần)
Hình 3.1. Biểu đồ hiệu quả khử trùng với các chất khử trùng khác nhau.
Từ biểu đồ hình 3.1 cho thấy: hiệu quả khử trùng cao nhất khi cĩ sự kết hợp giữa Javen (tỷ lệ 2:1) và Chlorine 5%, khi đĩ mẫu nhiễm đạt 33,33 %. Tỷ lệ mẫu chết cao nhất khi dùng Chlorine và thấp nhất khi dùng Javen. Tuy nhiên, khi kết hợp giữa Javen và Chlorine thì tỷ lệ mẫu chết khơng thấp hơn so với khi dùng dùng Javen đơn, nhưng kết quả mẫu tái sinh cao, đạt 50%. Sau 6 tuần các mẫu bắt đầu phát triển chồi ngọn hoặc chồi nách.
Kết luận: Qua kết quả nghiên cứu kỹ thuật khử trùng mẫu lan gấm cho thấy sử dụng Javen tỷ lệ 2:1 với thời gian khử trùng 10 phút sau đĩ kết hợp với Chlorine 5% thời gian khử trùng 5 phút thì kết quả mẫu tái sinh chồi đạt hiệu quả 50%
Nghiệm thức Tỷ
lệ %
.
Hình 3.2. Mẫu sau khi khử trùng
(a ) mẫu sống sau 4 tuần (b ) mẫu tái sinh sau 6 tuần
3.2. Tái sinh chồi
Khả năng tái sinh chồi mẫu là một trong những yếu tố quyết định sự thành cơng trong quy trình nhân giống bằng phương pháp nuơi cấy mơ tế bào thực vật. Đây là nguồn vật liệu khởi đầu cho việc nhân giống. Giai đoạn này, người ta thường bổ sung thêm các chất điều hịa sinh trưởng để kích thích sự phát triển của chồi. Tuỳ thuộc vào từng loại mẫu cấy, loại thực vật mà người ta bổ sung nồng độ các chất điều hịa sinh trưởng khác nhau. Trong tự nhiên, khả năng nhân nhanh của Lan gấm tương đối chậm, thường mỗi đoạn thân rễ cho từ 1-2 chồi con và thời gian tái sinh chậm. Vì vậy, nghiên cứu khả năng tái sinh chồi của lan gấm trongnuơi cấy mơ là một trong những cơng đoạn cần thiết.
Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, chúng tơi chỉ ứng dụng kết quả nghiên cứu tương tự để quan sát khả năng tái sinh chồi của lan gấm nên chúng tơi khơng khảo sát các yếu tố liên quan đến khả năng tái sinh chồi. Phạm vi nghiên cứu trong cơng đoạn này, chúng tơi sử dụng mơi trường khơng bổ sung chất điều hồ sinh trưởng và mơi trrường cĩ bổ sung chất điều hồ sinh trưởng (BA, kinetin, TDZ, và sự kết hợp). Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Khả năng tái sinh chồi mẫu cấy
Nghiệm thức Số chồi/mẫu Đặc điểm chồi
NT1 3 To khỏe, màu xanh
NT2 5 To khỏe, màu xanh
NT3 3 Màu vàng
NT4 Vừa tạo chồi vừa tạo protocorm
Chồi màu xanh, protocorm màu vàng xanh
NT5 1 Chồi ít phát triển ,nhỏ
- Mơi trường khơng cĩ chất kích thích, chỉ phát triển chồi ngọn hoặc chồi nách (Hình 3.3. a).
- Mơi trường cĩ bổ sung chất điều hồ sinh trưởng, số lượng chồi tạo trên mỗi mẫu cao trung bình 3-5 chồi/mẫu (Hình 3.3). Kết quả cho thấy trên mơi trường bổ sung BA và Kinetin thì mẫu hầu như chỉ phát triển thành chồi mà khơng phát triển protocorm. Kinetin là chất cĩ khả năng tái sinh chồi cao nhất (5 chồi/mẫu).
- Mơi trường cĩ bổ sung 0,1 mg/l TDZ, sự phát sinh hình thái chồi cĩ xu hướng chuyển sang tạo thành protocorm nhưng chưa rõ rệt (Hình 3.3.c).
- Mơi trường cĩ bổ sung cả 3 loại chất điều hồ sinh trưởng thì thấy xuất hiện chồi dạng protocorm (Hình 3.3. d), nhưng màu sắc của dạng chồi này cĩ màu trắng.
Kết luận: Khi bổ sung các chất điều hồ sinh trưởng thì khả năng tạo chồi mạnh hơn và số lượng chồi nhiều hơn. Nồng độ các chất kích thích sinh trưởng sử dụng trong các thí nghiệm này đều phù hợp và kết quả tái sinh chồi cao. Tuỳ mục đích lựa chọn phương pháp nhân giống bằng chồi hoặc đốt thân hoặc protocorm mà chúng ta áp dụng liều lượng nồng độ chất kích thích sinh trưởng trên để tái sinh chồi.
Hình 3.3. Sự tái sinh chồi
(a) Mơi trường bổ sung 0,3mg/l BA; (b) Bổ sung 0,3mg/l kinetin;
(c) Bổ sung 0,1 mg/l TDZ;
(d) Bổ sung 0,3mg/l BA+0,3mg/l kinetin+0,1 mg/l TDZ; (e) Khơng bổ sung chất điều hịa sinh trưởng.
a b
c d
3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng mơi trƣờng khống thích hợp để nhân nhanh chồi lan gấm lan gấm
Trong nuơi cấy mơ tế bào thực vật, thành phần mơi trường nuơi cấy đĩng vai trị rất quan trọng đối với mơ tế bào thực vật. Tuỳ mỗi loại cây trồng mà chọn lựa mơi trường nuơi cấy phù hợp để cây sinh trưởng phát triển tốt. Nếu mơi trường quá giàu dinh dưỡng đơi khi dẫn đến ngộ độc mơ tế bào trong giai đoạn nhân nhanh, ngược lại mơi trường nghèo dinh dưỡng dẫn đến cây chậm phát triển, hạn chế tốc độ nhân nhanh. Vì vậy, trong nghiên cứu này chọn mơi trường thích hợp để lan gấm phát triển.
Theo kết quả một số cơng trình nghiên cứu nuơi cấy phong lan, mơi trường thường sử dụng để nuơi cấy như MS (Murashige&Skoog, 1962); Knudson C, Vacine Went, mơi trường Hyponex ( Lou and Kako, 1995)…Lan gấm là một loại thuộc họ Phong lan, nên trong nghiên cứu này chúng tơi chọn mơi trường MS; Knudson C, Vacine Went, 1/2MS để khảo sát sự thích hợp của lan gấm. Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng mơi trường khống thích hợp nhân nhanh lan gấm. Nghiệm thức Mơi trƣờng Số chồi Đặc điểm chồi
NT1 1/2 MS 4 Chồi to, khỏe, màu xanh, cĩ từ 1-2 đốt
NT2 MS 3 Chồi to, khỏe, màu xanh
NT3 VW 3 Chồi phát triển chậm
NT4 K C 6 Chồi to, khỏe, màu xanh, cĩ 1-2 đốt Qua bảng 3.6 cho thấy: các mơi trường sử dụng khảo sát đều cĩ sự tạo chồi, nhưng số lượng chồi ở mơi trường Knudson C cho số lượng cao nhất 6 chồi/mẫu và các chồi này tương đối đồng đều. Các loại lan nĩi chung thường phát triển trên mơi trường cĩ hàm lượng khống thấp, nghèo chất dinh dưỡng như mơi trường Kundson C, mơi trường ½MS vì thế lan Gấm cĩ thể phát triển và tạo chồi tốt hơn các mơi trường khác. Nhưng trong mơi trường ½MS mặc dù cĩ hàm lượng khống thấp nhưng cĩ lượng vitamin và khống vi lượng phong phú hơn nên sẽ gây ức chế cho
mơ nuơi cấy làm cho mơ phát triển khơng tốt. Mơi trường MS và mơi trường VW là mơi trường giàu dinh dưỡng, nên quá trình phát triển cĩ thể gây độc cho mơ nuơi cấy nên hạn chế sự phát triển chồi.
Như vậy, mơi trường thích hợp để nuơi cấy thích hợp lan gấm giai đoạn invitro là mơi trường Knudson C.
Hình 3.4. Sự phát triển hình thái chồi trên các mơi trường khống
(a) Mơi trường MS; (b) Mơi trường WV; (c) Mơi trường 1/2MS; (d) Mơi trường KC
3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hịa sinh trƣởng đến khả năng nhân nhanh thể chồi nhanh thể chồi
Nhân nhanh chồi là bước quyết định và tạo hệ số nhân nhanh của phương pháp nuơi cấy mơ. Để tạo hệ số nhân nhanh, người ta thường bổ sung chất điều hồ sinh trưởng để tạo hệ số nhân chồi. Tùy mỗi loại cây, loại mơ cĩ nồng độ chất điều hồ sinh trưởng và loại chất điều hồ sinh trưởng phù hợp. Thơng thường người ta sử dụng nhĩm cytokinine để nhân nhanh chồi hoặc sự kết hợp với auxin. Trong phạm
a b
vi nghiên cứu của đề tài, chúng tơi chỉ khảo sát các chất BA, kinitine, TDZ để tạo số lượng chồi cao nhất.
3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi.
BA (6-benzyllaminopurin) là một cho cytokinine nhân tạo cĩ khả năng làm cho các chất dinh dưỡng trong mơi trường tập trung về vùng nĩ tác động, đồng thời kích thích sự phân chia và ưu thế ngọn bị ức chế dẫn đến hình thành cụm chồi. BA cĩ tác dụng kích thích sự hình thành, sinh trưởng và phát triển của chồi. Chính vì vậy trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành khảo sát nồng độ BA lần lượt là 0.0mg/l; 0.5mg/l; 1.0mg/l; 1.5mg/l; 2.0mg/l. Sau 6 tuần nuơi cấy, kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi
Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l)
Số
chồi/mẫu Số đốt/chồi Chất lƣợng chồi
NT1 (Đ/C) 0 1 2 + NT2 0.5 3 1 + NT3 1 4 2 ++ NT4 1.5 7 3 +++ NT5 2 3 3 ++ Chú thích:
+ + +: Tốt (chồi phát triển mạnh, lá to, xanh đậm)
+ + : Trung bình (chồi nhỏ, lá nhỏ hoặc k cĩ, màu xanh nhạt) + : Yếu (chồi nhỏ, lá nhỏ, màu xanh)
Qua bảng 3.7 cho thấy :
- Khi khơng bổ sung chất điều hịa sinh trưởng thì phát triển một chồi, nhưng khi cĩ sự cĩ mặt của BA số lượng chồi tăng và phát triển mạnh.
- Tại nồng độ BA 0.5 mg/l thì số lượng chồi là 03 chồi, nhưng khi tăng nồng độ BA lên 1 mg/l thì số lượng chồi tăng lên 4, chồi phát triển mạnh và cĩ 2 đốt. Số
lượng chồi cao nhất là 07 chồi/cụm khi nồng độ BA ở 1.5 mg/l. Đồng thời, tại nồng độ 1.5 mg/l BA thì số đốt/chồi tăng lên 3. Tuy nhiên, khi nồng độ BA 2.0 mg/l thì