c. Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:
3.3 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học cao ethanol ly trích từ cây Chỉ thiên giả
3.3.5 Khảo sát sự hiện diện của saponin
Thí nghiệm 1
Ống nghiệm 1: 5 mL NaOH 0.1N (pH=13) + 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử. Ống nghiệm 2: 5 mL HCl 0.1N (pH=1) + 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử.
Bịt miệng 2 ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống, để yên 15 phút và quan sát cột bọt trong 2 ống nghiệm.
Dấu hiệu nhận biết: nếu trong 2 ống nghiệm có cột bọt bền thì mẫu thử có chứa saponin.
Cho vào ống nghiệm lần lƣợt 4 ml, 5ml, 6 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml mẫu thử, thêm nƣớc cho vừa đủ 10 ml.
Bịt miệng các ống nghiệm, lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây, mỗi giây lắc 2 lần. Để yên 15 phút, quan sát chiều cao cột bọt trong mỗi ống.
Dấu hiệu nhận biết: nếu chiều cao của cột bọt trong các cột cao hơn 1 cm thì trong mẫu thử có chứa saponin.
Kết quả định tính saponin
Hình 10. Định tính saponin.
(1): Thí nghiệm 1: cả 2 ống nghiệm khơng có bọt, phản ứng âm tính.
(2): Thí nghiệm 2: tất cả các ống nghiệm đều khơng có bọt, phản ứng âm tính.
Kết luận: trong cao tổng không chứa saponin. 3.3.6 Khảo sát sự hiện diện của tannin
Thuốc thử tannin
Thuốc thử gelatin mặn
- Công thức: 5 g NaCl + 0.5 g gelatin + nƣớc cất vừa đủ 100mL. - Dấu hiệu nhận biết: có trầm hiện màu vàng nhạt, để lâu hóa màu nâu.
Thuốc thử Stiasny
- Dấu hiệu nhận biết: có trầm hiện màu đỏ.
Kết quả định tính tanin
Hình 11. Định tính tanin.
(1): Thuốc thử Gelatin mặn: không xuất hiện trầm hiện màu vàng, để lâu cũng khơng hóa nâu, phản ứng âm tính.
(2): Thuốc thử Stiasny: khơng xuất hiện trầm hiện màu đỏ, phản ứng âm tính.
Kết luận: trong cao tổng khơng có chứa tanin.
Bảng 1. Kết quả định tính một số nhóm hợp chất có trong cây Chỉ thiên giả
Nhóm chức Thuốc thử Hiện tƣợng Kết luận
Alkaloid
Mayer Kết tủa màu vàng
nhạt + Dragendorff Kết tủa cam + Wagner Kết tủa nâu sáng +
Steroid
Liebermann – Burchard Dung dịch màu
cam +
Salkowski Dung dịch màu
xanh +
Glycoside
Tollens Kết tủa đen Ag
kim loại + Felling A, B Kết tủa đỏ gạch + Saponin Thí nghiệm 1 Khơng có bọt - Thí nghiệm 2 Khơng có bọt - Flavonoid
1% NaOH/ethanol Kết tủa màu vàng + (CH3COO)2Pb Kết tủa trắng xanh +
Tanin
Gelatin mặn Dung dịch có màu
xanh -
Stiasny Dung dịch có màu
3.4 Điều chế các cao thơ từ cây Chỉ thiên giả 3.4.1 Điều chế cao ethanol (cao EtOH) 3.4.1 Điều chế cao ethanol (cao EtOH)
Mẫu nguyên liệu ban đầu có khối lƣợng 5.5 kg, sau khi phơi khô, nghiền thành bột (khối lƣợng 0.9 kg) đƣợc cho vào các túi vải nhỏ và đƣợc cho vào bình thủy tinh (thể tích 5 lít). Ngâm lƣợng mẫu này bằng 4 lít ethanol 95 (lúc này lƣợng dung mơi vừa ngập hết các túi vải). Sau khi ngâm khoảng 24 giờ, ta thu đƣợc dịch chiết màu xanh. Đem lọc dịch chiết bằng giấy lọc để loại bớt cặn, sau đó đem cơ quay thu hồi dung mơi. Phần cịn lại là cao EtOH có màu xanh đậm (120.848 g). Lƣợng dung mơi thu hồi đƣợc trong q trình cơ quay sẽ đƣợc cho trở lại vào bình thủy tinh để tiếp tục chiết.
Thời gian điều chế cao EtOH: 7 ngày.
Hiệu suất thu hồi cao EtOH so với lƣợng mẫu đem ngâm:
3.4.2 Điều chế các cao thành phần
Điều chế cao petroleum ether (cao PE)
Lấy 20 g cao EtOH điều chế ở trên đem chiết lỏng-lỏng với các dung mơi có độ phân cực tăng dần thu đƣợc các cao tƣơng ứng.
Đầu tiên hịa vào cao ethanol một ít nƣớc, cho hỗn hợp này vào bình lóng (khoảng 20-30 ml). Sau đó cho thêm vào bình lóng một lƣợng PE khoảng 200-300 ml, lắc đều. Sau khi lắc, để n bình lóng trên giá đỡ khoảng 30 phút, đợi đến khi hỗn hợp trong bình lóng phân thành 2 pha, pha hữu cơ có tỷ trọng trọng thấp hơn chứa các cấu tử tan trong PE nằm phía trên, phần nằm dƣới là pha nƣớc. Mở van bình lóng, hứng lấy pha nƣớc để điều chế tiếp các cao phân cực hơn. Thu lấy pha hữu cơ, làm khan nƣớc bằng Na2SO4, sau đó đem cơ quay thu hồi dung mơi ta có đƣợc cao PE (6 g).
Hiệu suất thu hồi cao PE:
% 428 . 13 100 900 848 . 120 % H % 30 100 20 6 % H
Điều chế cao ethyl acetate (cao EtOAc)
Pha nƣớc thu đƣợc sau khi chiết với PE tiếp tục đƣợc chiết lỏng-lỏng với EtOAc, dịch EtOAc thu đƣợc đem cô quay loại dung môi thu đƣợc cao EtOAc (6.36 g).
Hiệu suất thu hồi cao EtOAc:
Điều chế cao n-butanol (cao n-BuOH)
Pha nƣớc sau khi chiết với EtOAc tiếp tục đƣợc chiết lỏng-lỏng với n-BuOH, dịch n-BuOH thu đƣợc đem cô quay loại dung môi thu đƣợc cao n-BuOH (3.2 g).
Hiệu suất thu hồi cao n-BuOH:
% 8 . 31 100 20 36 . 6 % H % 16 100 20 2 . 3 % H
Hình 12. Quy trình điều chế cao thơ từ cây Chỉ thiên giả.
3.5 Khảo sát cao petroleum ether
Do cao PE có khối lƣợng đáng kể, TLC cho các vết rõ ràng, cũng nhƣ do thời gian thực hiện đề tài hạn chế nên chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát trên cao PE.
- Chiết với n-BuOH
- Cô quay, thu hồi dung môi Bôt cây khô (0.9 kg)
- Ngâm với Ethanol 950
- Cô quay, thu hồi dung môi Cao EtOH (120.848 g)
Mẫu cây tƣơi (5.5 kg) - Rửa sạch - Phơi gió - Xay nhỏ
- Chiết với PE
- Cô quay, thu hồi dung môi
Bã Cao PE (6 g)
- Chiết với EtOAc
- Cô quay, thu hồi dung môi
Bã Cao EtOAc (6.36 g)
Bã Cao n-BuOH (3.2 g)
3.5.1 Sắc ký cột thƣờng cao PE
Tiến hành sắc ký cột thƣờng cao PE với các số liệu nhƣ sau: Đƣờng kính cột: 4.5 cm.
Khối lƣợng pha tĩnh (silica gel 60 F254): 120 g. Khối lƣợng cao PE: 5 g.
Chiều cao cột silica gel: 20 cm.
Chiều cao lƣợng mẫu nạp trong cột là 1 cm. Dung môi ổn định cột: petroleum ether 100%. Phƣơng pháp nhồi cột: nhồi cột ƣớt.
Dung môi triển khai cột có độ phân cực tăng dần từ petroleum ether 100% đến ethyl acetate 100%.
Dung dịch ra khỏi cột đƣợc hứng vào các lọ có thể tích 30 mL theo thứ tự. Sau đó chấm TLC các lọ này theo thứ tự. Các vết chấm đƣợc so sánh trong cùng một bản mỏng và cùng một hệ dung môi giải ly bản mỏng, để việc so sánh giá trị Rf dễ dàng, từ đó gom chung các lọ có giá trị Rf giống nhau thành một phân đoạn. Dung dịch giải ly bản mỏng là H2SO4 20% trong MeOH.
Kết quả sắc ký cột cao PE nhƣ sau: Bảng 2. Kết quả sắc ký cột thƣờng cao PE Phân đoạn Hệ dung môi triển khai cột Hệ dung môi giải ly bản mỏng Kết quả TLC Ghi chú PE 0 PE 100% PE:Ea = 70:30 Vết dầu 0.21g PE I PE 100% PE:Ea = 70:30 1 vết màu nâu
và nhiều vết tạp
Dung dịch màu da cam, tinh thể màu đỏ (0.72g).
PE II PE:Ea = 99:1 PE:Ea = 70:30 1 vết màu nâu và nhiều vết tạp
Dung dịch màu vàng, tinh thể màu vàng (0.12g). PE III PE:Ea = 98:2 PE:Ea = 70:30 1 vết màu vàng
nâu và nhiều vết tạp
Dung dịch màu vàng chanh, tinh thể màu vàng (0.16g) PE IV PE:Ea = 97:3 PE:Ea = 70:30 1 vết màu nâu
và nhiều vết tạp
Dung dịch màu vàng nhạt,tinh thể màu vàng nhạt (0.092g) PE V PE:Ea = 96:4 PE:Ea = 70:30 1 vết màu nâu, 1
vết màu vàng
Dung dịch màu vàng nhạt, tinh thể màu vàng nhạt (0.095g) PE VI PE:Ea = 95:5 PE:Ea = 70:30 1 vết màu vàng,
1 vết màu nâu, 1 vết màu tím
Dung dịch sệt màu vàng nâu (0.274g)
Hiệu suất sắc ký cột thƣờng cao PE: % 054 . 30 100 5 274 . 0 0095 . 0 0092 . 0 16 . 0 12 . 0 72 . 0 21 . 0 % H 3.5.2 Sắc ký cột thƣờng phân đoạn PE VI
Tiến hành sắc ký cột thƣờng phân đoạn PE VI với các số liệu sau: Đƣờng kính cột: 1 cm.
Khối lƣợng pha tĩnh (silica gel 60 F254): 5 g. Khối lƣợng mẫu: 0.25 g.
Chiều cao cột silica gel: 12 cm.
Chiều cao lƣợng mẫu nạp trong cột: 0.6 cm. Dung môi ổn định cột: petroleum ether 100%. Phƣơng pháp nhồi cột: nhồi cột ƣớt.
Dung mơi triển khai cột có độ phân cực tăng dần từ petroleum ether 100% tới ethyl acetate 100%.
Dung dịch ra khỏi cột đƣợc hứng vào các lọ thể tích 1 mL theo thứ tự. Sau đó chấm TLC các lọ theo thứ tự. Các vết chấm đƣợc so sánh trong trong cùng một bản mỏng và cùng một hệ dung môi giải ly bản mỏng, để việc so sánh giá trị Rf dễ dàng. Dung dịch giải ly bản mỏng là H2SO4 20% trong MeOH.
Kết quả sắc ký cột phân đoạn PE VI nhƣ sau:
Bảng 3. Kết quả sắc ký cột thƣờng phân đoạn PE VI
Phân đoạn Thứ tự lọ Hệ dung môi triển khai cột Hệ dung môi giải ly bản mỏng Kết quả TLC Ghi chú
PE VI.1 1-30 PE 100% PE:Ea = 70:30 1 vết tạp Dung dịch không màu, tinh thể màu trắng ngà (0.007g). PE VI.2 31-50 PE:Ea = 99:1 PE:Ea = 70:30 1 vết màu
vàng, có vết tạp ở trên Dung dịch màu vàng nhạt, tinh thể màu vàng (0.009g).
PE VI.3 51-60 PE:Ea = 99:1 PE:Ea = 70:30 1 vết màu nâu, có vết vàng ở trên
Dung dịch không màu, tinh thể màu trắng ngà (0.001g). PE VI.4 61-
100
PE:Ea = 98:2 PE:Ea = 70:30 1 vết màu nâu, có vết tạp ở dƣới.
Dung dịch không màu, tinh thể màu trắng ngà (0.004 g). PE VI.5 101-
115
PE:Ea = 97:3 PE:Ea = 70:30 1 vết màu tím, có vết tạp ở trên.
Dung dịch khơng màu, tinh thể màu trắng ngà (0.001g). PE VI.6 115-
147
PE:Ea = 97:3 PE:Ea = 70:30 1 vết màu xanh
Dung dịch không màu, tinh thể màu trắng (0.009g). Xả cột MeOH
Hiệu suất sắc ký cột thƣờng phân đoạn PE VI: % 4 . 12 100 25 . 0 009 . 0 001 . 0 004 . 0 001 . 0 009 . 0 007 . 0 % H
Sau khi tiến hành sắc ký cột phân đoạn PE VI thì ở phân đoạn PE VI.6 thu đƣợc một chất kết tinh màu trắng, kết quả TLC chỉ cho một vết màu xanh. Khảo sát TLC của chất thu đƣợc trên 3 hệ dung mơi giải ly có độ phân cực khác nhau chỉ cho một vết nên tạm kết luận chất thu đƣợc tƣơng đối sạch, gọi là chất HN02(0.009g). Chúng tôi đã gửi đo phổ để xác định cấu trúc hóa học của chất HN02 này.
3.6 Khảo sát sơ bộ chất HN02
3.6.1 Khảo sát TLC với 3 hệ dung mơi có độ phân cực khác nhau
Hình 15. Kết quả TLC chất HN02 trong 3 hệ dung môi khác nhau.
(1): TLC đối chiếu HN02 với cao PE, hệ giải ly CH2Cl2:MeOH = 99:1 (Rf = 0.42).
(2) TLC HN02 hệ giải ly PE:Ea = 70:30 (Rf = 0.39). (3) TLC HN02 hệ giải ly CH2Cl2 100% (Rf = 0.24). Kết quả TLC cho thấy HN02 là chất sạch.
3.6.2 Một số đặc điểm của chất HN02
- Tinh thể hình kim, màu trắng.
- Khơng mùi: sau khi bay hơi dung mơi hồn tồn, dùng mũi ngửi khơng phát hiện mùi.
- Khơng có hoạt tính UV: sau khi giải ly bản mỏng, đem soi UV thì ở cả hai bƣớc sóng đều khơng phát hiện vết.
Hình 16. Dung dịch HN02 khơng màu và tinh thể HN02 màu trắng. 3.6.3 Khảo sát phổ NMR của chất HN02 3.6.3 Khảo sát phổ NMR của chất HN02
Phổ 1
H NMR (500 MHz, CDCl3, (ppm), J (Hz)) phổ đồ trình bày trong Phụ
lục 1.
Khảo sát phổ 1H NMR của chất HN02 cho ta các dữ liệu sau:
có 7 mũi cao và gần nhau nên có thể HN02 là một sterol.
H, d, J = 1, H6), 5.24 (1H, dd, J = 8, 7, H23),dd, J = 7.5), 4.7
(2H, t, J = 1.5, H26), 3.52 (1H, m, J = 5.5, H 2.17 (1H, s, -OH). Phổ 13
C NMR (500 MHz, CDCl3, (ppm)) thể hiện 28 tín hiệu C (Bảng 5), phổ đồ trình bày trong Phụ lục 2.
Phổ 13C NMR cho 6 tín hiệu trong vùng trƣờng thấp (100-150) là vùng trƣờng đặc trƣng cho C lai hóa sp2, dự đốn là >C=C<. Vậy có thể HN02 có 3 liên kết C=C trong phân tử.
Tại 71.82 cho mũi dƣơng trong phổ DEPT 90 và DEPT 135 là đặc trƣng của -CH-OH.
Phổ DEPT NMR kết hợp với phổ 13C NMR (phổ đồ trình bày trong Phụ lục
3) cho thấy có 5 nhóm -CH3, 9 nhóm -CH2, 10 nhóm –CH và 4C tứ cấp.
Tham khảo các dữ liệu trên, kết hợp với so sánh giữa dữ liệu phổ 1H-NMR của HN02 và dữ liệu phổ 1H-NMR của stigmasta-5,22,25-trien-3-ol (Bảng 4), chúng tôi đề nghị công thức của HN02 nhƣ sau:
HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Stigmasta-5,22,25-trien-3-ol 28 29
Bảng 4. So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR của HN02 trong dung môi CDCl3, 500 MHz với dữ liệu phổ 1
H-NMR của stigmasta-5,22,25-trien-3-ol trong dung môi CDCl3, 300 MHz.3 1H-NMR của HN02 ở 500 MHz, = ppm, J = Hz 1H-NMR của stigmasta-5,22,25-trien-3-ol ở 300 MHz, = ppm, J = Hz 3 0.69, 1.01 và 1.65 (s) 0.65, 0.98 và 1.65 (mỗi vị trí có 3H, s) 0.80 (d, J = 1.5) 0.80 (3H, d, J = 7.5) 0.96 (d, J = 5.5) 0.98 (3H, d, J = 6.5) 2.42 (q, J = 7.5, 7) 2.39 (1H, q, J = 7.5, H-24) 3.52 (m) 3.49 (1H, m, H-3) 4.70 (t, J = 3.5, 1.5) 4.67 (2H, br s, H-26) 5.17 (dd, J = 7.5) 5.15 (1H, dd, J = 15.2, 7.5, H-22) 5.24 (dd, J = 8, 7) 5.21 (1H, dd, J = 12.2, 7.5, H-23) 5.35 (d, J = 5) 5.32 (1H, d, J = 6.6, H-6)
Bảng 5. Dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của HN02 trong CDCl3
Vị trí C 13C-NMR ( ppm) DEPT 90 DEPT 135 Nhóm
1 31.7 Biến mất Mũi âm -CH2-
2 39.7 Biến mất Mũi âm -CH2-
3 71.8 Mũi dƣơng Mũi dƣơng >CH- 4 42.3 Biến mất Mũi âm -CH2-
5 148.6 Biến mất Biến mất >C= 6 137.2 Mũi dƣơng Mũi dƣơng -CH= 7 28.7 Biến mất Mũi âm -CH2-
8 40.2 Mũi dƣơng Mũi dƣơng >CH- 9 50.2 Mũi dƣơng Mũi dƣơng >CH- 10 42.3 Biến mất Biến mất >C< 11 28.7 Biến mất Mũi âm -CH2-
12 24.3 Biến mất Mũi âm -CH2-
13 36.5 Biến mất Biến mất >C< 14 31.9 Mũi dƣơng Mũi dƣơng >CH- 15 21.1 Biến mất Mũi âm -CH2-
16 25.7 Biến mất Mũi âm -CH2-
17 52.0 Mũi dƣơng Mũi dƣơng >CH- 18 12.1 Biến mất Mũi dƣơng -CH3
19 19.4 Biến mất Mũi dƣơng -CH3
20 55.9 Mũi dƣơng Mũi dƣơng >CH- 21 12.1 Biến mất Mũi dƣơng -CH3
22 121.7 Mũi dƣơng Mũi dƣơng -CH= 23 130.1 Mũi dƣơng Mũi dƣơng -CH= 24 56.9 Mũi dƣơng Mũi dƣơng >CH- 25 140.8 Biến mất Biến mất >C= 26 109.5 Biến mất Mũi âm =CH2
27 20.1 Biến mất Mũi dƣơng -CH3
28
Chƣơng 4
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1 Kết luận
Qua q trình thực hiện đề tài, tơi đã đạt đƣợc một số kết quả sau: Xác định độ ẩm của mẫu nguyên liệu cây Chỉ thiên giả là 8.186%.
Định tính sự hiện diện của các hợp chất hữu cơ trong cao EtOH tổng và xác định đƣợc có sự hiện diện của 4 nhóm hợp chất: flavonoid, steroid, flavonoid và glycoside.
Điều chế các cao gồm: cao EtOH tổng, cao PE, cao Ea, cao n-butanol. Xác
định khối lƣợng các cao và tính hiệu suất thu cao.
Sắc ký cột cao PE thu đƣợc nhiều phân đoạn, tiến hành khảo sát phân đoạn PE VI thu đƣợc 1 chất tinh khiết đặt tên là HN02 (0.095 g).
Khảo sát phổ NMR của HN02 và đối chiếu tài liệu tham khảo, chúng tôi đề nghị chất HN02 là stigmasta-5,22,25-trien-3-ol.
4.2 Kiến nghị
Do hạn chế về thời gian nên tôi chỉ khảo sát một phân đoạn của cao PE. Tôi hy vọng đề tài sẽ tiếp tục đƣợc phát triển theo các hƣớng sau:
Xác định hoạt tính sinh học của chất cơ lập đƣợc. Khảo sát các phân đoạn còn lại của cao PE.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH
(1) N. Shrivastava, T. Patel, (2007), Clerodendrum and healthcare: An overview
– Part I.
(2) N. Shrivastava, T. Patel, (2007), Clerodendrum and healthcare: An overview
– Part II, pp. 210 – 217.
(3) Yun-LianLin, Yueh-Hsiung Kuo and Yuh-Lin Chen, (1989), Two new
clerodane-type diterpenoid, clerodinins A and B from Clerodendrum brachyanthum schauer. Chem. Pharm Bull, pp. 2191 – 2193.