c. Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:
3.3 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học cao ethanol ly trích từ cây Chỉ thiên giả
3.3.1 Khảo sát sự hiện diện của alkaloid
Thuốc thử alkaloid
Thuốc thử Mayer
- Công thức:
Dung dịch A: 1.36 g HgCl2 + 60 mL nƣớc cất. Dung dịch B: 5 g KI + 10 mL nƣớc cất.
Hỗn hợp hai dung dịch A và B, thêm nƣớc cất vừa đủ 100 mL ta đƣợc thuốc thử Mayer.
- Dấu hiệu nhận biết: nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid lỗng có chứa alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt.
Thuốc thử Dragendorff
- Công thức:
Dung dịch A: 8 g Bi(NO)3.H2O + 25 mL HNO3 30% (d = 1.18). Dung dịch B: 28 g KI + 1 mL HCl 6N + 5 mL nƣớc cất.
Hỗn hợp hai dung dịch A và B, để yên trong tủ lạnh ở 5°C cho tủa màu sậm và tan trở lại, lọc, thêm nƣớc cất cho đủ 100 mL đƣợc thuốc thử Dragendorff.
- Dấu hiệu nhận biết: nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào dung dịch acid lỗng có chứa alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam-nâu.
Thuốc thử Wagner
- Công thức:
1.27 g I2 + 2 g KI + 20 mL nƣớc cất + nƣớc vừa đủ 100 mL.
- Dấu hiệu nhận biết: nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dung dịch acid chứa alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu.
Kết quả định tính alkaloid
Hình 6. Định tính alkaloid.
(1): Thuốc thử Mayer: kết tủa vàng nhạt, phản ứng dƣơng tính. (2): Thuốc thử Dragendorff: kết tủa cam, phản ứng dƣơng tính. (3): Thuốc thử Wagner: kết tủa nâu sáng, phản ứng dƣơng tính.
Kết luận: trong cao ethanol tổng có chứa alkaloid. 3.3.2 Khảo sát sự hiện diện của steroid
Thuốc thử steroid
Thuốc thử Liebermann-Burchard
- Công thức:
1 mL anhydrid acetic + 1 mL chloroform, làm lạnh, thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc.
- Dấu hiệu nhận biết: cho cao tổng vào ở thể rắn hoặc pha trong chloroform. Nếu có steroid thì dung dịch đổi màu thành xanh dƣơng, lục, cam hoặc đỏ: màu này khơng bền.
Thuốc thử Salkowski
Hịa tan 1-2 mg mẫu thử trong 1 mL chloroform và nhỏ thêm 1 mL H2SO4 đậm đặc.
Dấu hiệu nhận biết: phản ứng dƣơng tính khi dung dịch đổi màu thành đỏ đậm, xanh, xanh-tím.
Kết quả định tính steroid
Hình 7. Định tính steroid.
(1): Thuốc thử Liebermann – Burchard: dung dịch có màu cam, phản ứng dƣơng tính
(2): Thuốc thử Salkowski: dung dịch có màu xanh, phản ứng dƣơng tính.
Kết luận: trong cao tổng có chứa steroid. 3.3.3 Khảo sát sự hiện diện của flavonoid
Thuốc thử flavonoid
Thuốc thử chì acetate (CH3COO)2Pb: có tính kiềm, pha bão hịa trong nƣớc.
Dấu hiệu nhận biết: nhỏ dung dịch (CH3COO)2Pb vào ống nghiệm có dịch chứa flavol/etanol sẽ xuất hiện kết tủa keo màu trắng xanh. Thêm Na2SO4 vào ống nghiệm sẽ xuất hiện kết tủa màu trắng của PbSO4 lắng xuống đáy còn kết tủa trắng xanh vẫn lơ lửng trong ống nghiệm.
Thuốc thử 1% NaOH/ethanol
Dấu hiệu nhận biết: nhỏ dung dịch NaOH vào dung dịch flavonoid/ethanol sẽ có tủa từ vàng đến cam-đỏ.
(1) (2)
Kết quả định tính flavonoid
Hình 8. Định tính flavonoid.
(1): Thuốc thử 1% NaOH/ethanol: có tủa màu vàng, phản ứng dƣơng tính. (2): Thuốc thử chì acetate: tủa keo màu trắng xanh, phản ứng dƣơng tính.
Kết luận: trong cao tổng có chứa flavonoid. 3.3.4 Khảo sát sự hiện diện của glycoside
Thuốc thử glycoside
Thuốc thử Tollens
- Công thức: 0.5 mL AgNO3 10% + 0.5 mL NaOH 10% + từng giọt NH4OH cho đến khi tan hết tủa.
Cho vào ống nghiệm chứa 1-2 mg mẫu thử 5 giọt pyridine và 4 giọt thuốc thử vừa pha. - Dấu hiệu nhận biết: Phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện gƣơng bạc tráng trên thành ống nghiệm hoặc kết tủa màu đen của Ag kim loại.
Thuốc thử Felling A, B
- Công thức: Felling A: CuSO4.
Cho vào ống nghiệm vài giọt felling A, vài giọt felling B theo tỉ lệ 1:1, lắc, ta thấy xuất hiện màu xanh thẫm, thêm dung dịch mẫu thử rồi đem đun cách thủy.
- Dấu hiệu nhận biết: nếu có glycosid thì sau một thời gian đun sẽ xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch.
Kết quả định tính glycoside
Hình 9. Định tính glycosid.
1): Thuốc thử Tollen: xuất hiện kết tủa đen của Ag kim loại, phản ứng dƣơng tính.
(2): Thuốc thử Felling A, B: xuất hiện kết tủa đỏ gạch, phản ứng dƣơng tính.
Kết luận: trong cao tổng có chứa glycosid.
3.3.5 Khảo sát sự hiện diện của saponin (dựa vào chỉ số tạo bọt)
Thí nghiệm 1
Ống nghiệm 1: 5 mL NaOH 0.1N (pH=13) + 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử. Ống nghiệm 2: 5 mL HCl 0.1N (pH=1) + 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử.
Bịt miệng 2 ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống, để yên 15 phút và quan sát cột bọt trong 2 ống nghiệm.
Dấu hiệu nhận biết: nếu trong 2 ống nghiệm có cột bọt bền thì mẫu thử có chứa saponin.
Cho vào ống nghiệm lần lƣợt 4 ml, 5ml, 6 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml mẫu thử, thêm nƣớc cho vừa đủ 10 ml.
Bịt miệng các ống nghiệm, lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây, mỗi giây lắc 2 lần. Để yên 15 phút, quan sát chiều cao cột bọt trong mỗi ống.
Dấu hiệu nhận biết: nếu chiều cao của cột bọt trong các cột cao hơn 1 cm thì trong mẫu thử có chứa saponin.
Kết quả định tính saponin
Hình 10. Định tính saponin.
(1): Thí nghiệm 1: cả 2 ống nghiệm khơng có bọt, phản ứng âm tính.
(2): Thí nghiệm 2: tất cả các ống nghiệm đều khơng có bọt, phản ứng âm tính.
Kết luận: trong cao tổng không chứa saponin. 3.3.6 Khảo sát sự hiện diện của tannin
Thuốc thử tannin
Thuốc thử gelatin mặn
- Công thức: 5 g NaCl + 0.5 g gelatin + nƣớc cất vừa đủ 100mL. - Dấu hiệu nhận biết: có trầm hiện màu vàng nhạt, để lâu hóa màu nâu.
Thuốc thử Stiasny
- Dấu hiệu nhận biết: có trầm hiện màu đỏ.
Kết quả định tính tanin
Hình 11. Định tính tanin.
(1): Thuốc thử Gelatin mặn: không xuất hiện trầm hiện màu vàng, để lâu cũng khơng hóa nâu, phản ứng âm tính.
(2): Thuốc thử Stiasny: không xuất hiện trầm hiện màu đỏ, phản ứng âm tính.
Kết luận: trong cao tổng khơng có chứa tanin.
Bảng 1. Kết quả định tính một số nhóm hợp chất có trong cây Chỉ thiên giả
Nhóm chức Thuốc thử Hiện tƣợng Kết luận
Alkaloid
Mayer Kết tủa màu vàng
nhạt + Dragendorff Kết tủa cam + Wagner Kết tủa nâu sáng +
Steroid
Liebermann – Burchard Dung dịch màu
cam +
Salkowski Dung dịch màu
xanh +
Glycoside
Tollens Kết tủa đen Ag
kim loại + Felling A, B Kết tủa đỏ gạch + Saponin Thí nghiệm 1 Khơng có bọt - Thí nghiệm 2 Khơng có bọt - Flavonoid
1% NaOH/ethanol Kết tủa màu vàng + (CH3COO)2Pb Kết tủa trắng xanh +
Tanin
Gelatin mặn Dung dịch có màu
xanh -
Stiasny Dung dịch có màu
3.4 Điều chế các cao thô từ cây Chỉ thiên giả 3.4.1 Điều chế cao ethanol (cao EtOH) 3.4.1 Điều chế cao ethanol (cao EtOH)
Mẫu nguyên liệu ban đầu có khối lƣợng 5.5 kg, sau khi phơi khơ, nghiền thành bột (khối lƣợng 0.9 kg) đƣợc cho vào các túi vải nhỏ và đƣợc cho vào bình thủy tinh (thể tích 5 lít). Ngâm lƣợng mẫu này bằng 4 lít ethanol 95 (lúc này lƣợng dung mơi vừa ngập hết các túi vải). Sau khi ngâm khoảng 24 giờ, ta thu đƣợc dịch chiết màu xanh. Đem lọc dịch chiết bằng giấy lọc để loại bớt cặn, sau đó đem cơ quay thu hồi dung mơi. Phần cịn lại là cao EtOH có màu xanh đậm (120.848 g). Lƣợng dung mơi thu hồi đƣợc trong q trình cơ quay sẽ đƣợc cho trở lại vào bình thủy tinh để tiếp tục chiết.
Thời gian điều chế cao EtOH: 7 ngày.
Hiệu suất thu hồi cao EtOH so với lƣợng mẫu đem ngâm:
3.4.2 Điều chế các cao thành phần
Điều chế cao petroleum ether (cao PE)
Lấy 20 g cao EtOH điều chế ở trên đem chiết lỏng-lỏng với các dung mơi có độ phân cực tăng dần thu đƣợc các cao tƣơng ứng.
Đầu tiên hịa vào cao ethanol một ít nƣớc, cho hỗn hợp này vào bình lóng (khoảng 20-30 ml). Sau đó cho thêm vào bình lóng một lƣợng PE khoảng 200-300 ml, lắc đều. Sau khi lắc, để n bình lóng trên giá đỡ khoảng 30 phút, đợi đến khi hỗn hợp trong bình lóng phân thành 2 pha, pha hữu cơ có tỷ trọng trọng thấp hơn chứa các cấu tử tan trong PE nằm phía trên, phần nằm dƣới là pha nƣớc. Mở van bình lóng, hứng lấy pha nƣớc để điều chế tiếp các cao phân cực hơn. Thu lấy pha hữu cơ, làm khan nƣớc bằng Na2SO4, sau đó đem cơ quay thu hồi dung mơi ta có đƣợc cao PE (6 g).
Hiệu suất thu hồi cao PE:
% 428 . 13 100 900 848 . 120 % H % 30 100 20 6 % H
Điều chế cao ethyl acetate (cao EtOAc)
Pha nƣớc thu đƣợc sau khi chiết với PE tiếp tục đƣợc chiết lỏng-lỏng với EtOAc, dịch EtOAc thu đƣợc đem cô quay loại dung môi thu đƣợc cao EtOAc (6.36 g).
Hiệu suất thu hồi cao EtOAc:
Điều chế cao n-butanol (cao n-BuOH)
Pha nƣớc sau khi chiết với EtOAc tiếp tục đƣợc chiết lỏng-lỏng với n-BuOH, dịch n-BuOH thu đƣợc đem cô quay loại dung môi thu đƣợc cao n-BuOH (3.2 g).
Hiệu suất thu hồi cao n-BuOH:
% 8 . 31 100 20 36 . 6 % H % 16 100 20 2 . 3 % H
Hình 12. Quy trình điều chế cao thơ từ cây Chỉ thiên giả.
3.5 Khảo sát cao petroleum ether
Do cao PE có khối lƣợng đáng kể, TLC cho các vết rõ ràng, cũng nhƣ do thời gian thực hiện đề tài hạn chế nên chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát trên cao PE.
- Chiết với n-BuOH
- Cô quay, thu hồi dung môi Bôt cây khô (0.9 kg)
- Ngâm với Ethanol 950
- Cô quay, thu hồi dung môi Cao EtOH (120.848 g)
Mẫu cây tƣơi (5.5 kg) - Rửa sạch - Phơi gió - Xay nhỏ
- Chiết với PE
- Cô quay, thu hồi dung môi
Bã Cao PE (6 g)
- Chiết với EtOAc
- Cô quay, thu hồi dung môi
Bã Cao EtOAc (6.36 g)
Bã Cao n-BuOH (3.2 g)
3.5.1 Sắc ký cột thƣờng cao PE
Tiến hành sắc ký cột thƣờng cao PE với các số liệu nhƣ sau: Đƣờng kính cột: 4.5 cm.
Khối lƣợng pha tĩnh (silica gel 60 F254): 120 g. Khối lƣợng cao PE: 5 g.
Chiều cao cột silica gel: 20 cm.
Chiều cao lƣợng mẫu nạp trong cột là 1 cm. Dung môi ổn định cột: petroleum ether 100%. Phƣơng pháp nhồi cột: nhồi cột ƣớt.
Dung môi triển khai cột có độ phân cực tăng dần từ petroleum ether 100% đến ethyl acetate 100%.
Dung dịch ra khỏi cột đƣợc hứng vào các lọ có thể tích 30 mL theo thứ tự. Sau đó chấm TLC các lọ này theo thứ tự. Các vết chấm đƣợc so sánh trong cùng một bản mỏng và cùng một hệ dung môi giải ly bản mỏng, để việc so sánh giá trị Rf dễ dàng, từ đó gom chung các lọ có giá trị Rf giống nhau thành một phân đoạn. Dung dịch giải ly bản mỏng là H2SO4 20% trong MeOH.
Kết quả sắc ký cột cao PE nhƣ sau: Bảng 2. Kết quả sắc ký cột thƣờng cao PE Phân đoạn Hệ dung môi triển khai cột Hệ dung môi giải ly bản mỏng Kết quả TLC Ghi chú PE 0 PE 100% PE:Ea = 70:30 Vết dầu 0.21g PE I PE 100% PE:Ea = 70:30 1 vết màu nâu
và nhiều vết tạp
Dung dịch màu da cam, tinh thể màu đỏ (0.72g).
PE II PE:Ea = 99:1 PE:Ea = 70:30 1 vết màu nâu và nhiều vết tạp
Dung dịch màu vàng, tinh thể màu vàng (0.12g). PE III PE:Ea = 98:2 PE:Ea = 70:30 1 vết màu vàng
nâu và nhiều vết tạp
Dung dịch màu vàng chanh, tinh thể màu vàng (0.16g) PE IV PE:Ea = 97:3 PE:Ea = 70:30 1 vết màu nâu
và nhiều vết tạp
Dung dịch màu vàng nhạt,tinh thể màu vàng nhạt (0.092g) PE V PE:Ea = 96:4 PE:Ea = 70:30 1 vết màu nâu, 1
vết màu vàng
Dung dịch màu vàng nhạt, tinh thể màu vàng nhạt (0.095g) PE VI PE:Ea = 95:5 PE:Ea = 70:30 1 vết màu vàng,
1 vết màu nâu, 1 vết màu tím
Dung dịch sệt màu vàng nâu (0.274g)
Hiệu suất sắc ký cột thƣờng cao PE: % 054 . 30 100 5 274 . 0 0095 . 0 0092 . 0 16 . 0 12 . 0 72 . 0 21 . 0 % H 3.5.2 Sắc ký cột thƣờng phân đoạn PE VI
Tiến hành sắc ký cột thƣờng phân đoạn PE VI với các số liệu sau: Đƣờng kính cột: 1 cm.
Khối lƣợng pha tĩnh (silica gel 60 F254): 5 g. Khối lƣợng mẫu: 0.25 g.
Chiều cao cột silica gel: 12 cm.
Chiều cao lƣợng mẫu nạp trong cột: 0.6 cm. Dung môi ổn định cột: petroleum ether 100%. Phƣơng pháp nhồi cột: nhồi cột ƣớt.
Dung mơi triển khai cột có độ phân cực tăng dần từ petroleum ether 100% tới ethyl acetate 100%.
Dung dịch ra khỏi cột đƣợc hứng vào các lọ thể tích 1 mL theo thứ tự. Sau đó chấm TLC các lọ theo thứ tự. Các vết chấm đƣợc so sánh trong trong cùng một bản mỏng và cùng một hệ dung môi giải ly bản mỏng, để việc so sánh giá trị Rf dễ dàng. Dung dịch giải ly bản mỏng là H2SO4 20% trong MeOH.
Kết quả sắc ký cột phân đoạn PE VI nhƣ sau:
Bảng 3. Kết quả sắc ký cột thƣờng phân đoạn PE VI
Phân đoạn Thứ tự lọ Hệ dung môi triển khai cột Hệ dung môi giải ly bản mỏng Kết quả TLC Ghi chú
PE VI.1 1-30 PE 100% PE:Ea = 70:30 1 vết tạp Dung dịch không màu, tinh thể màu trắng ngà (0.007g). PE VI.2 31-50 PE:Ea = 99:1 PE:Ea = 70:30 1 vết màu
vàng, có vết tạp ở trên Dung dịch màu vàng nhạt, tinh thể màu vàng (0.009g).
PE VI.3 51-60 PE:Ea = 99:1 PE:Ea = 70:30 1 vết màu nâu, có vết vàng ở trên
Dung dịch không màu, tinh thể màu trắng ngà (0.001g). PE VI.4 61-
100
PE:Ea = 98:2 PE:Ea = 70:30 1 vết màu nâu, có vết tạp ở dƣới.
Dung dịch không màu, tinh thể màu trắng ngà (0.004 g). PE VI.5 101-
115
PE:Ea = 97:3 PE:Ea = 70:30 1 vết màu tím, có vết tạp ở trên.
Dung dịch khơng màu, tinh thể màu trắng ngà (0.001g). PE VI.6 115-
147
PE:Ea = 97:3 PE:Ea = 70:30 1 vết màu xanh
Dung dịch không màu, tinh thể màu trắng (0.009g). Xả cột MeOH
Hiệu suất sắc ký cột thƣờng phân đoạn PE VI: % 4 . 12 100 25 . 0 009 . 0 001 . 0 004 . 0 001 . 0 009 . 0 007 . 0 % H
Sau khi tiến hành sắc ký cột phân đoạn PE VI thì ở phân đoạn PE VI.6 thu đƣợc một chất kết tinh màu trắng, kết quả TLC chỉ cho một vết màu xanh. Khảo sát TLC của chất thu đƣợc trên 3 hệ dung mơi giải ly có độ phân cực khác nhau chỉ cho một vết nên tạm kết luận chất thu đƣợc tƣơng đối sạch, gọi là chất HN02(0.009g). Chúng tôi đã gửi đo phổ để xác định cấu trúc hóa học của chất HN02 này.
3.6 Khảo sát sơ bộ chất HN02
3.6.1 Khảo sát TLC với 3 hệ dung mơi có độ phân cực khác nhau
Hình 15. Kết quả TLC chất HN02 trong 3 hệ dung môi khác nhau.
(1): TLC đối chiếu HN02 với cao PE, hệ giải ly CH2Cl2:MeOH = 99:1 (Rf = 0.42).
(2) TLC HN02 hệ giải ly PE:Ea = 70:30 (Rf = 0.39). (3) TLC HN02 hệ giải ly CH2Cl2 100% (Rf = 0.24). Kết quả TLC cho thấy HN02 là chất sạch.
3.6.2 Một số đặc điểm của chất HN02
- Tinh thể hình kim, màu trắng.
- Khơng mùi: sau khi bay hơi dung mơi hồn tồn, dùng mũi ngửi không phát hiện mùi.
- Khơng có hoạt tính UV: sau khi giải ly bản mỏng, đem soi UV thì ở cả hai bƣớc sóng đều khơng phát hiện vết.
Hình 16. Dung dịch HN02 khơng màu và tinh thể HN02 màu trắng. 3.6.3 Khảo sát phổ NMR của chất HN02 3.6.3 Khảo sát phổ NMR của chất HN02
Phổ 1
H NMR (500 MHz, CDCl3, (ppm), J (Hz)) phổ đồ trình bày trong Phụ
lục 1.
Khảo sát phổ 1H NMR của chất HN02 cho ta các dữ liệu sau: