4. Phƣơng pháp nghiên cứu và thực nghiệm
4.4 Các phƣơng pháp phân tích
4.4.1 Xác định nồng độ Phycocyanin, độ tinh khiết của Phycocyanin trong dịch chiết và hiệu suất đạt đƣợc [11] dịch chiết và hiệu suất đạt đƣợc [11]
Từ dịch chiết thu đƣợc sau khi ly tâm, lấy chính xác 2ml định mức đến 100 ml. Tiến hành đo độ hấp thu quang phổ bằng máy quang phổ UV – Vis UV1 với bƣớc sóng trong khoảng 200 nm đến 700 nm để lấy giá trị độ hấp thu của dịch chiết ở các bƣớc sóng: 280 nm, 615 nm, 652 nm. Nồng độ Phycocyanin (PC) Nồng độ PC đƣợc xác định theo công thức: 34 , 5 )) ( 474 , 0 (OD615 OD652 PC Trong đó: PC là hàm lƣợng Phycocyanin (mg/ml).
OD615 là độ hấp thu quang phổ của PC ở bƣớc sóng 615 nm. OD652 là độ phát thải huỳnh quang của PC ở bƣớc sóng 652 nm. Độ tinh khiết (EP)
Độ tinh khiết của Phycocyanin trong dịch chiết đƣợc xác định theo tỷ số:
280 615 OD OD EP Trong đó: EP là chỉ số độ tinh khiết.
OD280 là độ hấp thu quang phổ của protein ở bƣớc sóng 280 nm. Hiệu suất (%Y)
100 % DB V PC Y
Trong đó:
%Y là hiệu suất chiết Phycocyanin (%). V là thể tích dung mơi (ml).
DB là khối lƣợng sinh khối khô tuyệt đối (mg).
4.4.2 Phân tích hàm lƣợng protein trong dịch chiết
Hàm lƣợng protein tổng trong dịch chiết đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp Lowry. Cơ sở của phƣơng pháp này là dựa vào phản ứng màu của protein với thuốc thử Folin tạo thành phức chất có màu xanh hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 750 nm. Cƣờng độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ protein. Phƣơng pháp này có độ nhạy cảm cao cho phép xác định dung dịch mẫu chứa vài chục microgram protein.
Phƣơng pháp tiến hành phân tích:
- Xây dựng đƣờng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc giữa độ hấp thu theo nồng độ dung dịch protein chuẩn. Dãy dung dịch protein chuẩn có nồng độ tăng dần từ 0 – 0,4 mg/ml từ dung dịch protein gốc (BSA 1 mg/ml NaCl 0,9%).
- Dùng thuốc thử Folin 1N cho thấy sự đổi màu của các dung dịch, dung dịch có màu càng đậm chứa hàm lƣợng protein càng cao.
- Đo độ hấp thụ của từng dung dịch trên máy quang phổ.
- Vẽ đƣờng chuẩn về sự phụ thuộc của độ hấp thụ A vào nồng độ dung dịch protein chuẩn.
- Xác định hàm lƣợng protein trong mẫu phân tích:
Lấy 0,5 ml dung dịch cần xác định hàm lƣợng protein (1 mg/ml NaOH 0,1 N) cho vào ống nghiệm, cho thêm 5,5 ml dung dịch C. Lắc đều, để ở nhiệt độ phòng 10 phút. Tiếp tục cho thêm 0,5 ml thuốc thử Folin 0,5 N rối lắc đều, dung dịch protein sẽ chuyển từ màu vàng sang màu xanh biển do phản ứng màu của protein với thuốc thử Folin, để yên 30 phút và đo độ hấp thụ của dung dịch trên máy đo quang phổ ở bƣớc sóng 750 nm, rồi đƣa vào đƣờng chuẩn. Từ giá trị độ hấp thụ đo đƣợc và đƣờng chuẩn có thể suy ra đƣợc nồng độ protein trong mẫu tƣơng ứng.
Bảng 2.2 Xây dựng đƣờng chuẩn theo phƣơng pháp Folin – Lowry
- Dung dịch protein chuẩn: dung dịch albumin huyết thanh bò (BSA – bovine serum albumin) 1mg/ml pha trong dung dịch NaCl 0,9%.
- Dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1 N.
- Dung dịch B: CuSO4.5H2O 0,5% trong kali natri tartrat 1%.
- Dung dịch C: Pha dung dịch A và B theo tỷ lệ thể tích 50:1 trƣớc khi dùng.
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nồng độ dung dịch protein (mg/ml) 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 Thể tích dung dịch protein chuẩn (l) 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Thể tích dung dịch NaOH 0,01 N (l) 1000 950 900 850 800 750 700 650 600 Thể tích dung dịch kiềm (C ) (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Thuốc thử Folin (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Độ ẩm của mẫu nguyên liệu
Lƣợng nƣớc trong mẫu nguyên liệu tảo tƣơi là 81,64%.