2.1.2 Một số biến đổi của nước ép trái cây họ có múi trong q trình gia nhiệt
2.1.2.1. Hƣ hỏng do vi sinh vật.
Theo FDA, nước ép có tính acid (pH ≤ 4,6) có thể tồn tại những vi sinh vật gây bệnh như E. coli O157:H7, các chủng Salmonella, và loài ký sinh đơn bào Cryptosporidium parvumhave có thể gây ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng (FDA,
2017). Trong đó, E.Coli O157:H7 và Salmonella spp là nhóm vi sinh vật đích, được
kiểm sốt chặt chẽ trong ngành cơng nghiệp chế biến sản phẩm nước trái cây có múi (FDA, 2017).
2 Serovar: Kiểu huyết thanh. Serovars” = Sero + Variants, phân chia của một loài hoặc phân loài phân biệt với các dòng khác nhau dựa trên cơ sở kháng nguyên.
11
Các vi sinh vật gây bệnh E.coli, Salmonella khơng phát triển trong nước trái cây có pH thấp nhưng có thể sống sót và thích nghi với điều kiện mơi trường acid (Yang et
al.,2012; Sharma et al.,2005). Chúng có thể nhiễm vào sản phẩm nước trái cây qua
nguồn nước bị nhiễm bẩn, hoặc thiếu kiểm sốt trong suốt q trình chế biến. FDA đã thực hiện một chương trình HACCP để xử lý và kiểm soát vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm trong nước quả và báo cáo rằng mục tiêu sau quá trình xử lý nhiệt hiệu quả là giảm 5 log đối với những vi sinh vật gây bệnh này (Guidance & Edition, 2017).
a) Phƣơng trình động học bất hoạt vi sinh vật
Phương trình biểu diễn số tế bào vi sinh vật trong mẫu cịn sống sót sau thời gian xử lý nhiệt t là:
N=No.e-kt.
Trong đó, N là số tế bào vi sinh vật cịn sống sót sau khi gia nhiệt No là số tế bào vi sinh vật ban đầu
k là hằng số phá hủy t là thời gian xử lý nhiệt
Hiệu quả vơ hoạt VSV bằng nhiệt được trình bày dưới dạng logarit thập phân số tế bào vi sinh vật sống sót trên số tế bào vi sinh vật ban đầu:
Log Với D =
Khi thì t = D, D được gọi là thời gian phá hủy thập phân.
Thơng số chính để đánh giá tính chịu nhiệt của một loại vi sinh vật là giá trị D. Nó là thời gian xử lý cần thiết để giảm 90% lượng vi sinh vật tại một nhiệt độ xác định hay nói cách khác là một chu kỳ logarit. Theo Murphy et al. (2000) gía trị D được xác định như sau: Đồ thị thể hiện mức độ sống xót của vi sinh vật được vẽ thơng qua giá trị logarithm số khuẩn lạc sống sót theo thời gian xử lý tại một nhiệt độ xác định. Mơ hình tuyến tính bậc nhất dùng để xác định thời gian giảm thập phân D:
X = X0 + at Trong đó:
X - log(N) của số tế bào vi sinh vật cịn sống sót ở thời điểm t X0 - log(N0) của số tế bào vi sinh vật cịn sống sót ban đầu
a - hệ số góc của đường cong
12
Thời gian giảm thập phân (giá trị D) được xác định thơng qua đường cong sống sót của vi sinh vật theo thời gian tính theo hàm logarithm. Giá trị D (phút) được xác định tại mỗi nhiệt độ bằng cách lấy trừ nghịch đảo hệ số góc.
- Xác định giá trị z (Murphy et al., 2000):
Khoảng tăng nhiệt độ cần thiết để giá trị D của vi sinh vật giảm đi 10 lần được gọi là giá trị z. Giả sử thời gian phá hủy thập phân của một loài vi sinh vật là ở nhiệt độ , và D ở nhiệt độ T, thì giữa chúng có mối liên hệ theo biểu thức sau:
log
Thông số động học D, z cho phép so sánh những kĩ thuật gia nhiệt khác nhau khi xét đến hiệu quả tiêu diệt VSV.
b) Cơ chế tiêu diệt vi sinh vật do nhiệt, điện.
Trong gia nhiệt Ohm, tác động của nhiệt vẫn là yếu tố ảnh hưởng đến sự bất hoạt vi sinh vật, sự có mặt của điện sẽ có tác động gia tăng hiệu quả tiêu diệt vi sinh. Palaniappan, Sastry, and Richter (1992) tìm thấy khơng có sự khác nhau khi xét ảnh hưởng của xử lý nhiệt Ohm và xử lý nhiệt truyền thống đến động học gây chết nấm men Zygosaccharomyces bailli trong dung dịch đệm phosphate tại nhiệt độ và thời
gian xử lý. Tuy nhiên với E.coli, yêu cầu về nhiệt để bất hoạt chúng giảm xuống khi có yếu tố điện, nghĩa là điện trường làm giảm khả năng kháng nhiệt của VSV .
Khác với Palaniappan & Sastry (1992), Park and Kang (2013) kết luận có sự bất hoạt VSV do ảnh hưởng của điện trong môi trường suốt quá trình gia nhiệt. Nghiên cứu được thực hiện với đối tượng là những vi sinh vật gây bệnh như E.coli, Salmonella, Listeria. Kết quả cũng cho thấy gia nhiệt Ohm tiêu diệt VSV cao hơn từ 2-
3 log so với gia nhiệt truyền thống.
Pereira et al. (2007) khảo sát tính kháng nhiệt điện của bào tử Bacillus licheniformis bằng cả hai phương pháp, gia nhiệt Ohm và gia nhiệt truyền thống với
cùng điều kiện nhiệt độ với đối tượng là mức dâu. Kết quả chỉ ra rằng thời gian cần thiết để vô hoạt bào tử giảm khi gia nhiệt Ohm, tức là ngoài tác động do nhiệt sự có mặt của điện trường trong gia nhiệt Ohm cung cấp một tác động giết chết bào tử. Thời gian giảm thập phân (giá trị Z) thì giống nhau ở các kiểu xử lý (ztruyền thống = 11,4°C và zOhmic = 11,1°C), chỉ ra rằng sự hiện diện của dòng điện ảnh hưởng đến tỉ lệ chết, nhưng không ảnh hưởng đến nhiệt độ vô hoạt bào tử.
Khả năng bất hoạt tăng thêm khi có tác động của điện được giải thích là do sự điện di. Tế bào chết vì thiếu chất nội bào, vì bị rị rỉ qua lỗ thủng trên màng (Yoon, Lee, Kim, & Lee, 2002). Do đó, điện di gây nguy hại cho tế bào và sẽ gia tăng ảnh hưởng gây chết khi gia nhiệt Ohm.
13
Để làm sáng tỏ cơ chế tác động của điện đến khả năng bất hoạt vi sinh vật, Park & Kang (2013) đã sử dụng phương pháp phân tích cấu trúc bằng kĩ thuật chụp TEM và xác định mức độ hấp thu PI. TEM chỉ ra những thay đổi có thể nhìn thấy được về hình thái học của tế bào nhưng không chỉ ra giá trị định lượng. Giá trị hấp thu PI định lượng được sự hư hỏng vi sinh vật. PI phát xạ huỳnh quang khi kết hợp với acid nucleic, PI khơng đi qua màng tế bào khi nó cịn ngun vẹn. Đo độ hấp thu PI là một chỉ số để đánh giá tính thấm của màng tế bào hay sự vỡ, thủng của màng.
Hình thái bên ngồi của tế bào VSV trong các mẫu thực phẩm xử lý nhiệt truyền thống và Ohm được xác định thông qua chụp TEM. Sự khác nhau về hình ảnh của E.
Coli khi gia nhiệt truyền thống và gia nhiệt Ohm được chỉ ra trong ảnh cho thấy sự
phân hủy cấu trúc (vách tế bào và màng cytoplasmic) và sự rò rỉ cơ chất bên trong tế bào khi xử lý nhiệt truyền thống ít hơn so với Ohm. Với gia nhiệt Ohm, hiện tượng này xảy ra rõ ràng hơn, màng tế bào chất bị vỡ và rỉ dịch nội bào. Hiện tượng này xảy ra làm chết tế bào sau 30s (Park & Kang, 2013). Bên cạnh đó, độ hấp thu PI trong tế bào tăng dần phụ thuộc vào thời gian gia nhiệt (Hình 2.5). Mức độ hấp thu PI khi gia nhiệt Ohm thì cao hơn khi gia nhiệt truyền thống. Dựa vào mối liên hệ giữa sự hấp thu PI và lượng VSV bị tiêu diệt có thể kết luận được nhiệt và điện tăng phá vỡ màng tế bào.
Hiệu quả bất hoạt vi sinh của gia nhiệt Ohm cao hơn so với gia nhiệt truyền thống nhờ vào sự tác động của cả nhiệt và điện. Ảnh hưởng bất hoạt vi sinh vật khi có mặt điện nhờ vào sự điện di của màng tế bào, liên quan đến sự di chuyển điện tích do sự khác nhau giữa thế bên trong và ngoài tế bào, do tác động của điện trường nên hình thành các lỗ trên màng lipid kép và protein của tế bào, kết quả là tăng tính thấm và sự khuếch tán các chất qua màng (Castro, Barbosa-canovas, & Swanson, 1993). (Palaniappan et al., 1992) đã báo cáo rằng ảnh hưởng của điện trường thì khơng đủ để làm giảm vi sinh vật khi gia nhiệt Ohm. Tuy nhiên, tác động gây chết VSV do hiện tượng điện di tế bào là một yếu tố quan trọng khi kết hợp nhiệt. Điện trường trung bình gây ra quá trình điện di ngược trong màng tế bào (Barbosa-Canovas GV, Pierson MD, Howard Zhang QQ, 2000). Mặc dù, sự điện di ngược là một hiện tượng nhất thời nhưng gây ra tác dụng diệt khuẩn rất lớn ở một nhiệt độ nào đó. Tác động điện gây ra hiện tượng điện di được chứng minh phụ thuộc vào cường độ điện trường, thời gian phát xung, và tổng số các xung tác động. Người ta cho rằng sự phá vỡ tế bào do điện hoặc cơ chế điện di chiếm ưu thế đối với ảnh hưởng của gia nhiệt Ohm. Những tác động này diễn ra ở tần số thấp (thường là 50-60Hz). Tại tần số thấp này các lỗ rỗng của màng tế bào vi sinh vật sống tích điện và hình thành các lỗ rỗng (Cho, Yousef, & Sastry, 1996).
14
2.1.2.2 Sự biến đổi các chất có hoạt tính sinh học đặc trƣng của nƣớc ép bƣởi
Sự biến đổi các tính chất hóa lí, vi sinh và cảm quan của nước ép trái cây họ có múi phản ánh chất lượng của sản phẩm nước ép chế biến. Do đó, nghiên cứu và ứng dụng các cơng nghệ mới để giảm thiểu những biến đổi đến chất lượng của sản phẩm nước ép luôn được các nhà sản xuất quan tâm. Với khía cạnh hóa lý, các chỉ tiêu về hàm lượng vitamin C (đại diện cho chất nhạy nhiệt), hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá trong nghiên cứu này.
a) Vitamin C (Acid ascorbic)
Nước ép của các loại quả có múi là nguồn cung cấp nhiều loại vitamin và khoáng chất, đặc biệt là vitamin C. Vitamin C hay acid ascorbic, là một dưỡng chất cần thiết cho cơ thể ngăn chặn bệnh scurvy (bệnh liên quan đến việc chảy máu chân răng, chậm lành vết thương, các mảng thâm tím rộng trên da), đóng vai trị như một chất chống oxy hóa trung hịa các gốc tự do có trong cơ thể (Drake et al., 1996)(Sanderson, 2018). Acid ascorbic tham gia vào nhiều phản ứng sinh hóa của cơ thể như hấp thụ sắt vô cơ, ức chế sự hình thành nitrosamine, hình thành collagen, giảm lượng cholesterol và tăng cường hệ miễn dịch (Getoff, 2013) (Toohey, Harris, Allen, & Melby, 1996). Acid ascorbic rất dễ bị oxy hóa bởi tác nhân hóa học và enzyme trong quá trình chế biến và bảo quản sản phẩm. Các enzyme như phenolase, cytochrome oxidase và peroxidase tác động gián tiếp đến việc làm suy giảm acid ascorbic (S. K. Lee & Kader, 2000) (Mapson 1957). Ngồi ra, acid ascorbic cịn rất nhạy cảm với những yếu tố khác như nhiệt độ cao, ánh sáng, khơng khí, sự có mặt của các ion kim loại nặng (Cu2+, Ag+), pH kiềm (S. K. Lee & Kader, 2000).
Chế độ thanh trùng ngăn chặn sự hoạt động của enzyme acid ascorbic oxidase nhưng lại làm thất thoát hàm lượng vitamin C. Kaleem và các cộng sự đã nghiên cứu tác động nhiệt đến vitamin C trong nước ép quả tươi và nước ép đóng hộp, tác giả đã chỉ ra mối quan hệ giữa nhiệt độ và hàm lượng vitamin C là tỷ lệ nghịch với nhau, có nghĩa là nhiệt độ càng tăng, lượng vitamin C càng giảm (Kaleem, Tanveer, Iqbal, Abbas, & Abdullah, 2015). Quá trình chế biến trái cây tươi thành các sản phẩm nước ép sẽ làm mất một phần vitamin C, và việc bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ cao cũng dẫn đến sự tổn thất đáng kể hàm lượng vitamin C. Khoảng nhiệt độ tác động đến tỷ lệ mất mát vitamin C trong quá trình bảo quản tùy thuộc vào từng loại trái cây họ citrus (Nagy, 1980).
b) Hoạt tính chống oxi hóa
Q trình oxi hóa là ngun nhân dẫn đến một số bệnh lão hóa ở người, kể cả ung thư (Jacob, 1995). Những năm vừa qua, những nghiên cứu về chất chống oxi hóa tự nhiên
15
đã tăng lên đáng kể, vai trò của chúng đối với sức khỏe con người ngày càng được chú trọng vì chất chống oxi hóa được cung cấp từ thực phẩm đóng vai trị quan trọng trong việc bắt gốc tự do (Farzaneh & Carvalho, 2015). Một chế độ ăn giàu trái cây và rau quả được coi là nguồn cung cấp các chất chống oxi hóa tự nhiên. Cam, chanh, quýt và bưởi luôn được coi là nguồn thực phẩm cung cấp chất chống oxi hóa dồi dào cho cơ thể (Ho, 1992). Trong một số cơng trình nghiên cứu cho thấy khơng có sự thay đổi đáng kể hoạt tính chống oxi hóa trong một số loại nước trái cây nào đã qua xử lý nhiệt ở nhiệt độ dưới 90℃. Đối với các loại nước ép họ citrus, hoạt tính chống oxi hóa của ngun liệu tươi và xử lý nhiệt ở 60oC khác biệt không đáng kể (Jose´ A. Larrauri, Pilar Rupe´rez, 1997). Các kết quả nghiên cứu cho thấy, nước ép trái cây khi được ủ trong nước nóng (90℃) trong các khoảng thời gian khác nhau, ngay cả sau 60 phút, hoạt tính chống oxi hóa thay đổi khơng đáng kể (Ali et al., 2017). Tuy nhiên, khi các mẫu nước ép này được xử lí ở nhiệt độ từ 100℃ trở lên, hoạt tính chống oxi hóa của mẫu đã bị ảnh hưởng rõ rệt. Với họ citrus, ngồi vitamin C là hợp chất chống oxy hóa chính, cịn có những hợp chất chống oxy hóa khác như các hợp chất phenol. Một số báo cáo cho thấy mối quan hệ chặt chẽ giữa tổng hàm lượng phenol và hoạt tính chống oxy hóa (Rapisarda et al., 1999)(Ramful, Tarnus, Aruoma, Bourdon, & Bahorun, 2011). Khi gia nhiệt ở nhiệt độ trên 100℃, hàm lượng phenolic sẽ giảm đáng kể. Maillard and Berset (1995) đã đề xuất ba giả thuyết để giải thích cho sự giảm các acid phenolic khi mẫu gia nhiệt ở nhiệt độ cao. Theo họ, hàm lượng các acid phenolic bị giảm thiểu đáng kể, một là nhiệt độ cao phân giải các hợp chất phenolic liên kết, liên kết giữa acid phenolic và lignin hoặc arabinoxylans bị bẻ gảy. Hai là lignin bị thoái hóa, giải phóng dẫn xuất phenolic acids. Ba là sự thoái nhiệt của các hợp chất phenolic. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, khi nhiệt độ gia nhiệt là 100℃ và 140℃, hàm lượng polyphenol của dịch chiết bắt đầu giảm đáng kể (18,6% và 32,6%), cũng như giảm hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu tương ứng khoảng 28% và 50% so với mẫu ban đầu (Hamamat & Nawar, 1991). Kết quả này cho thấy nhiệt độ cao (từ 100℃ trở lên) là cơ chế chính của q trình suy giảm hàm lượng polyphenol cũng như hoạt tính chống oxi hóa của các loại trái cây và rau quả, bao gồm hoa quả họ citrus.
Mặt khác, khi nước trái cây mới được ép và bảo quản dưới tác động của ánh sáng trong 4 ngày, hoạt tính chống oxi hóa của các loại nước ép này cũng thay đổi đáng kể, nước cam giữ lại được hoạt tính chống oxi hóa của nó, trong khi nước ép chanh, quýt hay bưởi bị mất hơn 70% (Ali et al., 2017). Điều này cho thấy ánh sáng mặt trời có thể làm suy giảm nhiều chất dinh dưỡng, trong đó bao gồm cả chất chống oxi hóa. Mỗi loại chất chống oxi hóa trong các loại trái cây và rau quả sẽ có những biến đổi khác nhau khi chịu tác động bởi nhiệt và ánh sáng.
16
2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Nguyên liệu
Bưởi Năm Roi, tên khoa học là Citrus Grandis (hoặc C. Decumana) được cung cấp từ các tỉnh miền Tây Nam Bộ, có hình quả lê, khối lượng 1,0±0,2 kg. Nguyên liệu chọn là những quả có da căng, láng, có màu xanh ngã vàng, được kiểm sốt độ chín thơng qua giá trị độ brix, pH, và độ dẫn điện. Bưởi được gọt vỏ, bỏ xơ và tách lấy múi ép qua máy ép Fujiyama -FJ-400, có đường kính lỗ rây 1 mm. Nước ép bưởi để làm thí nghiệm phải đạt các chỉ tiêu sau: oBrix 11,0 ± 0,5, pH 4,0 ± 0,2, độ dẫn điện 4,0 ± 0,5 mS/cm. Nước bưởi sau khi ép được bảo quản lạnh ở 0 oC trước khi tiến hành thí nghiệm.
2.2.2 Chủng và huyền phù tế bào VSV
Chủng E.coli O157:H7 (ATCC 43888) và Salmonella enteritidis (ATCC 13076) được sử dụng cho thí nghiệm này. Chủng VSV được chuẩn bị như sau:
Khuẩn lạc của mỗi chủng được nuôi cấy trên môi trường TSA (Tryptic Soy Agar). Cấy vào 5 mL canh tryptic soy (TSB) ủ 37oC, 24h. Thu nhận bằng quay ly tâm 4000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC. Rửa 3 lần bằng nước peptone 0,2% (PW). Sau đó bổ