Bệnh lở cỗ rễ do các loại nấm trong đất đặc biệt là Rhizoctonia solani gây ra, bệnh chủ yếu tấn công vào cây con nên để phòng trừ bệnh này ta cần áp dụng một số biện pháp phòng trừ như sau:
- Làm đất kĩ, lên luống cao, san phẳng mặt luống không để ứ đọng nước. - Sử dụng hạt giống tốt, có sức nảy mầm cao, không nên gieo hạt giống quá sâu. Nên xử lý hạt giống bằng thuốc trước khi gieo và phun thuốc khi bệnh mới vừa xuất hiện.
- Luân canh nhiều loại cây trồng, không nên độc canh một loại cây nào đó. - Gieo trồng đúng thời vụ với từng loại cây trồng.
- Bón phân thích hợp, cân đối. Chú ý, phải làm đất, bón lót bằng phân hữu cơ và vôi trước khi gieo trồng. Tránh bón phân quá nhiều đạm.
- Có thể dùng thêm các loại thuốc sau để phòng trừ: Ridomil MZ72 WB, Topsin M, Rovral,… theo liều lượng khuyến cáo của nhà sản xuất.
Phần 2: PHẦN THỰC NGHIỆM. 2.1 Các dụng cụ - phương tiện thí nghiệm.
2.1.1 Dụng cụ - thiết bị.+ Bình xịt thuốc lọai 0.5l và 2.5l. + Bình xịt thuốc lọai 0.5l và 2.5l. + Khay xốp. + Ống nghiệm các loại. + Erlen các loại. + Dĩa Petri. + Bếp đun. + Đèn cồn.
+ Máy đo quang phổ tử ngoại. + Máy đo OD.
2.1.2 Hóa chất.+ Acetone 80%. + Acetone 80%. + Cloroform. + Nước cất. + Cồn 700 và 900. 2.1.3 Vật liệu thí nghiệm. + Cải xanh.
2.1.4 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo.
Để thực hiện quá trình lây bệnh nhân tạo, các loài cây mẫn cảm được trồng trong các điều kiện có kiểm soát và được cấy vi sinh vật nghi là gây bệnh. Việc lây bệnh nhân tạo có thể cung cấp thông tin để:
• Khẳng định một sinh vật nào đó được phân lập là tác nhân gây bệnh (theo quy tắc Koch).
• Xác định phổ ký chủ của tác nhân gây bệnh.
• Đo độc tính các mẫu cấy khác nhau của tác nhân gây bệnh.
Khi chọn lựa những cây khỏe mạnh để lây bệnh nhân tạo theo quy tắc Koch, nên lưu ý dùng cùng một giống với cây bị bệnh mà từ đó tác nhân gây bệnh được phân lập. Như vậy các triệu chứng biểu hiện khi lây bệnh nhân tạo sẽ rất gần với các
triệu chứng bệnh ban đầu ngoài tự nhiên - các giống cây trồng có thể có độ mẫn cảm khác nhau đáng kể đối với một tác nhân gây bệnh.
Các yếu tố cần được cân nhắc trong quá trình lây bệnh nhân tạo bao gồm: • Nhiệt độ.
• Độ ẩm. • Dinh dưỡng.
• Nguồn bệnh (quá ít hoặc quá nhiều) • Các điều kiện trồng nói chung.
Nếu tất cả thí nghiệm và công thức lây bệnh đều được bố trí các công thức đối chứng (không lây bệnh) để so sánh với các công thức được lây bệnh, ảnh hưởng của những yếu tố này có thể được đo và giải thích. Công thức đối chứng cũng là một phương tiện để so sánh và có thể làm nổi bật các thiếu sót trong thí nghiệm nếu có.
Một phần quan trọng của việc chẩn đoán bệnh là việc tái tạo bệnh trong quá trình lây bệnh nhân tạo nhằm hoàn tất các quy tắc Koch. Bệnh có thể được tái tạo bằng cách cấy tác nhân gây bệnh lên bề mặt cây trồng theo cơ chế xâm nhiễm của tác nhân đó, hoặc bằng cách đưa mầm bệnh trực tiếp vào cây. Chọn phương pháp nào là tùy thuộc vào tác nhân gây bệnh được thí nghiệm (Bảng 2.1).
Bảng 2.1: Phương pháp lây nhiễm thích hợp.
2.1.4.1 Lây bệnh vào đất.
Có thể lây bệnh trực tiếp vào đất bằng dung dịch bào tử lấy từ môi trường thuần hoặc từ sinh khối vi sinh vật gây bệnh được nhân trong bình tam giác (Hình 2.1). Dịch bào tử nấm hoặc dịch khuẩn có thể được tưới vào đất sau khi nảy mầm sao
cho chúng được tiếp xúc trực tiếp với hệ thống rễ. Phương pháp này được thực hiện để lây bệnh nhanh ban đầu.
Hỗn hợp Lớp mỏng Dịch bào tử
Hình 2.1 Các phương pháp lây bệnh nhân tạo bằng cách đưa vi sinh vật vào đất. Một quá trình lây nhiễm tự nhiên hơn được thực hiện bằng phương pháp hỗn hợp hoặc phương pháp lớp mỏng. Cả hai phương pháp này đều yêu cầu nhân sinh khối nguồn bệnh trên một giá thể tự nhiên, như hạt kê hoặc vỏ trấu. Việc nhân sinh khối mẫu cấy trên các giá thể này trong bình tam giác cần thời gian khoảng 2-3 tuần. Một lượng sinh khối nguồn bệnh tiêu chuẩn được dùng cho cả hai phương pháp. Tuy nhiên do tác nhân gây bệnh được đưa vào đất cùng thời điểm trồng cây nên cây có thể nhiễm bệnh khi còn ở giai đoạn cây con - việc này có thể gây ra các kết quả sai lệch nếu mục đích của lây bệnh nhân tạo là để tái tạo bệnh trên cây trưởng thành.
2.1.4.2 Chuẩn bị nguồn bệnh cho quá trình lây bệnh nhân tạo.
• Dịch bào tử.
Chuẩn bị nguồn nấm bệnh cho việc tạo dịch bào tử bằng cách nuôi nấm trên môi trường thạch nước cất chứa hạt, mẩu thân hoặc lá đã khử trùng, trên môi trường thạch lá cẩm chướng, hoặc trên môi trường thạch đường khoai tây.
Một cách đơn giản là cạo các bào tử và sợi nấm ra khỏi đĩa cấy và cho vào nước vô trùng. Dịch bào tử này có thể được đổ lên trên đất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. Chắt bỏ phần nước, trộn cám vào, cho thêm nước.
3. Cho khoảng 150ml giá thể vào một bình tam giác thể tích 250 ml.
4. Cuộn thật chặt một nút bông gòn, bọc ngoài bằng vải màn để nút chặt miệng bình tam giác.
Hình 2.2 Bình lúa/cám.
5. Dùng giấy nhôm phủ lên miệng bình và hấp khử trùng 6. Để bình nguội.
7. Cấy các miếng thạch có sợi nấm hoặc dịch bào tử vào giá thể trong bình tam giác, chú ý để nút bình vẫn trong điều kiện vô trùng, thao tác này được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
8. Đặt các bình tam giác ở nhiệt độ khoảng 250C trong 2 tuần trong điều kiện sáng và tối xen kẽ để hoàn thành quá trình nhân sinh khối nấm trên giá thể.
9. Lắc bình tam giác 2-3 ngày sau khi cấy để đảm bảo nguồn bệnh được phân bố đều trong giá thể.
2.2 Quá trình thí nghiệm – kết quả.
Hình 2.3 Bịch hạt giống.
Cải dùng làm thí nghiệm được trồng từ hạt giống mua ở công ty Gino. Được trồng trong các khay xốp, giá thể để trồng là xơ dừa trộn với đất và phân trùng quế.
Tiến hành trồng cải trong 4 khay xốp khác nhau (K1, K2, K3, K4) với mật độ vừa phải và theo hướng dẫn của nhà cung cấp và một số tài liệu tham khảo được.
Hình 2.5 Cải dùng làm thí nghiệm.
Trong 5 ngày đầu (từ khi hạt được gieo cho đến khi nảy mầm) cây được tưới nước mỗi ngày.
Sau đó cây cải được tưới nước cách nhật (1 ngày tưới – 1 ngày ngưng).
Các cây cải sau khi trồng được 15 ngày, cây có chiều cao khoảng 5cm, tiến hành phun riêng các hóa chất Na-Glutamat, K-Glutamat và Mg-Glutamat (với nồng độ 0.5 g/l) trên 3 khay khác nhau (K1, K2, K3) và 1 đối chứng (K4) không phun hóa chất gì cả.
Sau 3 ngày phun thuốc, tiến hành lây nhiễm nhân tạo bằng nấm Rhizoctonia Solani (được nhân giống từ trước) vào 3 khay đã phun hóa chất (K1, K2, K3) và 1 khay đối chứng (K4).
Sau vài ngày, các cây cải đã có dấu hiệu xuất hiện bệnh. Ta tiến hành chọn ngẫu nhiên một số cây mang đi phân tích môt số chỉ tiêu sau:
2.2.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hàm lượng Chlorophyll.
- Bố trí thí nghiệm: Các mẫu lá (5 lá) được lấy một cách ngẫu nhiên, sau đó cắt mỗi lá một phần nhỏ và cân đủ 25 mg. Các mẩu lá được lấy theo sơ đồ như sau:
Hình 2.6. Sơ đồ các vị trí lấy mẫu.
- Mô tả thí nghiệm: Phương pháp đo Chlorophyll (Arnon D. I, 1949).
- Mỗi nghiệm thức lấy 10 mẫu. Mỗi mẫu cân 25 mg lá (lá xanh tốt) và cắt nhuyễn. Cho từng mẫu vào ống nghiệm, sau đó dùng pipet 10 ml hút và cho vào mỗi ống nghiệm 10 ml aceton 80%. Đậy kín ống nghiệm bằng giấy bạc và nilon và để các mẫu không tiếp xúc ánh sáng trong 72 giờ.
- Đồng thời cân mỗi nghiệm thức 10 mẫu lá có trọng lượng mỗi mẫu là 25 mg. Gói giấy và đem sấy khô ở nhiệt độ 800C trong 72 giờ. Suy ra trọng lượng khô trung bình A của mỗi mẫu đo Chlorophyll.
- Sau 72 giờ, mang đi đo mật độ quang của từng ống nghiệm ở 2 bước sóng 645 nm và 663 nm bằng máy đo quang phổ.
- Hàm lượng chlorophyll a và b được tính theo công thức sau: + Chl a (mg/g TLK lá) = mA Abs Abs663) (2.69* 645))*10 * 7 . 12 (( − + Chl b (mg/g TLK lá) = mA Abs Abs645) (4.68* 663))*10 * 9 . 22 (( − Khay trồng cải. Các vị trí lấy mẫu. 50 cm. 27 c m .
+ Chl a+b (mg/g TLK lá) = mA Abs Abs663) (20.29* 645))*10 * 02 . 8 (( + + Tỷ lệ Chlorophyll a/b = Chl a / Chl b. - Trong đó:
mA: Trọng lượng khô của lá. Chl a: Chlorophyll a.
Chl b: Chlorophyll b.
- Chỉ tiêu ghi nhận: các số liệu đo được dùng để đánh giá mối tương quan về hàm lượng Chlorophyll a và Chlorophyll b trong các nghiệm thức. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.2 Thí nghiệm 2: Đo quang phổ tử ngoại.
- Bố trí thí nghiệm: Các lá đuợc lấy một cách ngẫu nhiên như sơ đồ lấy mẫu ở (hình 2.6).
- Mô tả thí nghiệm: Cân 1g lá, giã nhuyễn cho thêm 10ml nước cất, lọc và cho vào ống nghiệm, sau đó mang đi đo.
Về thí nghiệm này, các kết quả được đo bằng máy chuyên dụng, và được xử lí bằng một phần mềm chuyên dụng riêng.
Quá trình đo quang bằng máy chuyên dụng, sinh viên thực tập không được sử dụng máy, chỉ được đứng quan sát.
Quá trình xử lí số liệu của kết quả đo này thì vô cùng phức tạp và phải dùng phần mềm chuyên biệt, sinh viên thực tập không có được.
Sau khi có kết quả đo, số liệu sau đó được KS. HỨA QUYẾT CHIẾN (cán bộ hướng dẫn thực tập chính của chúng tôi) xử lí riêng sau đó đưa kết quả (ở phần 3) cho chúng tôi. Sau đó, ông (KS. HỨA QUYẾT CHIẾN) đã hướng dẫn chúng tôi đọc các kết quả và rút ra kết luận từ các số liệu này.
+ Protein = 1552*A280 – 757.3*A260 (µg/ml). + Axit Nucleic = -36*A280 + 62.9*A260 (µg/ml).
Trong đó: A280 và A260 là cường độ thu được ở bước sóng 280 nm và 260 nm.
- Chỉ tiêu ghi nhận: Ghi nhận sự thay đổi về hàm lượng Protein và Axit nucleic có trong các nghiệm thức.
Phần 3: THẢO LUẬN KẾT QUẢ. 3.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hàm lượng Chlorophyll.
Thực vật là những sinh vật có khả năng tạo cho mình những chất dinh dưỡng từ những hợp chất vô cơ đơn giản và tổng hợp thành những phần tử phức tạp nhờ quá trình quang hợp. Quá trình quang hợp sử dụng năng lượng của ánh sáng mặt trời được hấp thụ bởi chất diệp lục (Chlorophyll), phân tách nước thành hydro và oxy sau đó tổng hợp thành các chất hữu cơ - chất dinh dưỡng phục vụ cho bản thân chúng và hầu hết các sinh vật trên trái đất, đồng thời tạo ra oxy và thiết lập sự cân bằng Oxy- Nitơ-Cacbonic cho bầu khí quyển.
Cấu trúc hóa học của Chlorophyll gần giống Hemoglobin ở máu người, cũng gồm 4 nhóm heme gắn với một nguyên tố kim loại, ở người là nguyên tố sắt, còn ở thực vật và tảo, nguyên tố Magnesium thay thế cho nguyên tố Sắt. Người ta còn gọi chất diệp lục (Chlorophyll) là máu của thực vật.
Hình 3.1 Cấu trúc hóa học của Chl a và Chl b.
Tác dụng chính yếu của Chlorophyll là phân tách nước, một số hợp chất vô cơ đơn giản mà thực vật hút từ đất, tạo ra Hydro, Oxy, hình thành ATP là nguồn năng
chất đạm, dinh dưỡng cho thực vật. Do có tác dụng tạo ra nguyên tử Oxy bề mặt mà Chlorophyll có tác dụng diệt khuẩn, đặc biệt là các vi khuẩn kỵ khí.
Về cơ bản công thức hóa học của 2 loại Chlorophyll chỉ khác nhau ở gốc -CH3 (của Chl a) và gốc –CH=O (của Chl b).
Diệp lục có khả năng hấp thu rất mạnh các tia sáng có bước sóng xác định. Chl a có đỉnh hấp thu ở bước sóng λ= 410 nm, 429 nm ở ánh sáng xanh và 660 nm ở ánh sáng đỏ. Chl b có đỉnh hấp thu ở bước sóng λ= 430 nm, 453nm ở ánh sáng xanh và 642 ở ánh sáng đỏ.
- Kết quả thí nghiệm: hàm lượng Chlorophyll được ghi nhận ở bảng 3.1: Bảng 3.1 Kết quả đo OD ở 2 bước sóng 645 nm và 663 nm.
Bước sóng Hóa chất 645 nm 663 nm BT 0.245 0.562 K 0.181 0.429 Na 0.202 0.559 Mg 0.191 0.426 .
+ BT: mẫu nhiễm bệnh, chỉ tưới nước, không phun thuốc. + K: mẩu nhiễm bệnh, được phun Kali Glutamat.
+ Na: mẩu nhiễm bệnh, được phun Natri Glutamat. + Mg: mẩu nhiễm bệnh, được phun Mg Glutamat.
Hàm lượng Chlorophyll a và Chlorophyll b sau khi tính bằng các công thức trên, ta có bản sau đây: Ta chỉ tính hàm lượng Chlorophyll mẫu làm thí nghiệm.
Bảng 3.2. Hàm lượng Chlorophyll trong các cây cải thí nghiệm.
Chl a (mg) Chl b (mg) Chl a + Chl b Chl a / Chl b
BT 6.47835 2.98034 9.47829 2.17
Na 6.55592 2.00968 8.58176 3.26
K 4.96141 2.13718 7.11307 2.32
Mg 4.89641 2.38022 7.29191 2.06
+ BT: mẫu nhiễm bệnh, chỉ tưới nước, không phun thuốc. + K: mẩu nhiễm bệnh, được phun Kali Glutamat. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Na: mẩu nhiễm bệnh, được phun Natri Glutamat. + Mg: mẩu nhiễm bệnh, được phun Mg Glutamat.
Biểu đồ 3.1 Hàm lượng Chl a và Chl b trong từng mẫu thí nghiệm.Ở đây, ta chỉ tính hàm lượng của Chlorophyll a và Chlorophyll b trong lá, vì Ở đây, ta chỉ tính hàm lượng của Chlorophyll a và Chlorophyll b trong lá, vì trong các kết quả của thí nghiệm này ta chỉ quan tâm đến hàm lượng của các loại Chlorophyll mà thôi, không quan tâm đến kết quả Chlorophyll /TLK của lá.
Trong kết quả của thí nghiệm này, ta thấy:
+ Hàm lượng Chl a trong cả thí nghiệm và đối chứng đều cao hơn nhiều so với Chl b.
+ Hàm lượng Chl a trong mẫu có phun Natri Glutamat gần bằng với hàm lượng Chl a trong mẫu đối chứng (BT).
+ Hàm lượng Chl a trong mẫu có phun Kali Glutamat và Mg Glutamat thì gần như nhau và thấp hơn nhiều so với mẫu đối chứng (BT).
+ Trong khi đó, hàm lượng Chl b trong các mẫu có phun thuốc thì thấp hơn nhiều so với mẫu BT, trong đó, mẫu có phun Natri Glutamat có hàm lượng thấp nhất và mẫu có phun Mg Glutamat thì lại có hàm lượng cao nhất.
Nhưng nếu chúng ta xét về tổng thể, có thể thấy rằng hàm lượng Chlorophyll tổng cộng (Chl a + Chl b) trong mẫu (BT) là cao nhất (9.47829 mg) và trong mẫu (K) là thấp nhất (7.11307 mg).
3.2 Thí nghiệm 2: Đo quang phổ tử ngoại.
- Kết quả thí nghiệm: khi tiến hành đo quang phổ tử ngoại ở vùng bước sóng của ánh sáng tử ngoại ta thu được các cường độ ở các bước sóng như (bảng 3.3)
Bảng 3.3 Cường độ thu được ở các bước sóng.
Hóa chất Bước sóng BT Na K Mg A260 nm 0.28913 0.18475 0.58852 0.16855 A280 nm 0.39337 0.3166 0.79952 0.4479 A320 nm 3.2191 1.6377 3.5421 2.4438 A340 nm 2.8624 1.3591 3.1894 2.0676 A360 nm 1.8604 0.8311 2.3912 1.3212 A380nm 1.0282 0.45263 1.7192 0.75532 Trong đó:
+ BT: mẫu nhiễm bệnh, chỉ tưới nước, không phun thuốc. + K: mẩu nhiễm bệnh, được phun Kali Glutamat.
+ Na: mẩu nhiễm bệnh, được phun Natri Glutamat. + Mg: mẩu nhiễm bệnh, được phun Mg Glutamat. + A: bước sóng. (nm).
Áp dụng công thức xác định nồng độ (µg/ml) Protein và Axit nucleic: + Protein = 1552*A280 – 757.3*A260 (µg/ml).
+ Axit Nucleic = -36*A280 + 62.9*A260 (µg/ml). ta được kết quả như bảng 3.4
Bảng 3.4 Nồng độ Protein và axit nucleic.
Nồng độ
Hóa chất Protein (µg/ml). Axit nucleic (µg/ml).
BT 392.064251 4.013077
K 795.168844 8.235188
Na 351.452025 0.223175
Mg 567.497885 Không xác định.
Trong kết quả thí nghiệm này, ta thấy các mẫu cây cải lấy từ nghiệm thức có phun Kali Glutamat lại có sự khác biệt lớn với các nghiệm thức còn lại. Nồng độ (µg/ml) Protein và Axit Nucleic cao gần như gấp đôi so với mẫu đối chứng (BT). (dựa vào bảng 3.4 , hình 3.4 , hình 3.5 )
Biểu đồ 3.2 Nồng độ (µg/ml) Protein.
Biểu đồ 3.3 Nồng độ (µg/ml) Axit nucleic.
Với nghiệm thức được phun Mg Glutamat, nồng độ Protein tuy có cao nhưng