CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.5. Phương pháp HPLC định lượng quercetin trong cao Diếp cá
2.2.5.1. Điều kiện HPLC định lượng quercetin Cột sắc ký: X.Terra RP18, 250 x 4,6 mm, 5 µm. Pha đợng: CH3CN-H2O (55:45).
Detector: UV-Vis.
Bước sóng phát hiện: 370 nm. Tốc đợ dịng: 0,85 ml/phút. Thể tích bơm: 30 µl.
Nhiệt đợ cợt: 25 – 30oC.
2.2.5.2. Cách pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử
Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 1 mg chuẩn đối chiếu quercetin cho vào bình định mức 10 ml, hịa tan với methanol, siêu âm và bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm để có dung dịch chuẩn đối chiếu có nồng đợ khoảng 100 µg/ml.
Dung dịch thử nghiệm: cân chính xác khoảng 10 mg cắn chloroform cho vào bình
định mức 5 ml, hịa tan với methanol, siêu âm và bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm để có dung dịch thử có nồng đợ khoảng 2000 µg/ml. 2.2.5.3. Thẩm định quy trình phân tích [3]
Khảo sát tính tương thích hệ thống
Bơm 6 lần dung dịch thử. Khảo sát các thông số: thời gian lưu, diện tích đỉnh. Xử lý thống kê số liệu các giá trị sau:
- Giá trị trung bình - Đợ lệch chuẩn
- Đợ lệch chuẩn tương đối
Khảo sát tính tuyến tính
Khảo sát sự tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của quercetin trong cao Diếp cá: pha các dung dịch mẫu chuẩn có nồng đợ khác nhau, bơm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao và ghi nhận các diện tích đỉnh. Từ đó, thiết lập phương trình hồi quy yˆ = Bx + Bo.
Tính thích hợp của phương trình yˆ= f(x) được đánh giá bằng trắc nghiệm F. Ý nghĩa của các hệ số B và Bo được kiểm tra đánh giá bằng trắc nghiệm t.
Tiến hành lặp lại 6 lần quy trình chiết và định lượng trên cùng mợt mẫu cao và ghi nhận kết quả. Tiến hành xử lý thống kê, xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD).
Khảo sát độ đúng
Thêm lượng chất chuẩn quercetin tương ứng với khoảng 80%, 100%, 120% hàm lượng quercetin có trong mẫu thử. Bơm vào hệ thống HPLC và ghi nhận diện tích đỉnh ở bước sóng phù hợp. Xác định tỷ lệ phục hồi ở từng nồng độ thêm vào, tính tỷ lệ hồi phục trung bình.
2.2.6. Thiết lập và tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao Diếp cá
Thiết lập mơ hình thực nghiệm: mơ hình thực nghiệm được thiết kế bởi phần
mềm Design-Expert gồm 14 quy trình chiết xuất được trình bày trong Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Mơ hình D-Optimal Thí nghiệm x1 x2 x3 1 C 1/8 3 2 B 1/10 2 3 C 1/10 2 4 B 1/8 2 5 A 1/10 2 6 A 1/10 3 7 C 1/9 3 8 A 1/8 3 9 A 1/8 2 10 B 1/9 3
11 C 1/10 3 12 B 1/9 2 13 A 1/9 3 14 C 1/9 3 Biến độc lập: x1 = độ cồn (A, B, C) x2 = tỷ lệ DL/DM (1/8, 1/9, 1/10) x3 = số lần chiết (2 lần, 3 lần) Biến phụ thuộc:
y1 = hiệu suất chiết cao (%)
y2 = hàm lượng quercetin trong cao Diếp cá (%)
Quy trình chiết xuất
Thơng số đợ cồn, tỷ lệ DL/DM, số lần chiết thay đổi theo thiết kế, những thơng số khác của quy trình được giữ cố định.
Phân tích dữ liệu
Phần mềm thơng minh FormRules được sử dụng để nghiên cứu liên quan nhân quả. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất được thực hiện bởi phần mềm thơng minh INForm.
Thực nghiệm kiểm chứng
Thơng số quy trình chiết xuất tối ưu được áp dụng để tiến hành 2 thực nghiệm kiểm chứng và so sánh với kết quả dự đoán.
2.2.7. Xây dựng phương pháp kiểm nghiệm cao Diếp cá
2.2.7.1. Hình thức cảm quan
Thực hiện theo DĐVN III, phụ lục 1.1, trang PL-9. 2.2.7.2. Độ tan trong nước
Cân khoảng 1 g bột cao Diếp cá cho vào becher 250 ml. Thêm vào 100 ml nước cất. Khuấy thật kĩ cho tan. Để yên 15 phút và quan sát.
Nếu dung dịch đồng nhất: cao hơi tan trong nước.
Nếu dung dịch không đồng nhất: cao khó tan hoặc khơng tan trong nước. 2.2.7.3. Độ tan trong cồn
Cân khoảng 1 g bột cao Diếp cá cho vào becher 50 ml. Thêm vào 30 ml dung dịch cồn có đợ cồn xác định. Khuấy thật kĩ cho tan. Để yên 15 phút và quan sát.
Nếu dung dịch đồng nhất: cao tan trong cồn có đợ cồn xác định.
Nếu dung dịch khơng đồng nhất: cao khó tan hoặc khơng tan trong cồn có đợ cồn xác định. Thử nghiệm với các dung dịch cồn có đợ cồn thay đổi từ 10-96%.
2.2.7.4. Cắn không tan trong nước
Tiến hành: cân khoảng 1 g cao, hòa trong 50 ml nước cất trong cốc có mỏ. Lọc qua
giấy lọc đã cân bì trước, sấy khô ở 100oC, để ng̣i 1 giờ trong bình hút ẩm. Cân, tính phần trăm cắn khơng tan trong nước so với khối lượng cao.
2.2.7.5. Độ ẩm
Thực hiện theo DĐVN III, phụ lục 9.6, trang PL-143. 2.2.7.6. Độ tro
Tro toàn phần
Thực hiện theo DĐVN III, phụ lục 7.6, trang PL-129, phương pháp 2.
Tro không tan trong acid
Thực hiện theo DĐVN III, phụ lục 7.5, trang PL-128.
Tro tan trong nước
Thực hiện theo DĐVN III, phụ lục 7.8, trang PL-129. 2.2.7.7. pH
Cân khoảng 1 g bợt cao Diếp cá, hịa trong 200 ml nước cất đun sôi để nguội. Lọc, lấy dịch lọc, dùng dịch lọc để đo pH.
2.2.7.8. Kim loại nặng
Thực hiện theo DĐVN III, phụ lục 7.4.7, trang PL-126. 2.2.7.9. Định tính
Bằng phản ứng hóa học
Lấy khoảng 0,5 g bợt cao Diếp cá, hịa trong 20 ml cồn 96%, đun nhẹ trên cách thủy cho tan, lọc và lấy dịch lọc chia ra 3 ống nghiệm và làm các phản ứng:
- Phản ứng với dung dịch NaOH 10%: nhỏ vài giọt thuốc thử NaOH 10% sẽ thấy dung dịch thử chuyển sang màu vàng sáng.
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: nhỏ vài giọt thuốc thử FeCl3 5% sẽ thấy dung dịch thử chuyển sang màu xanh dương.
- Phản ứng cyanidin (bột Mg kim loại + HClđđ, đun nóng): thêm vào dung dịch thử ít bợt Mg và 3 giọt HClđđ, đun nóng trên cách thủy sẽ xuất hiện màu đỏ.
Bằng SKLM: đối chiếu với quercetin chuẩn
Bản mỏng: silica gel 60 F254 (Merck).
Hệ dung môi: toluene-chloroform-acetone (8:5:7).
Phát hiện: soi UV ở bước sóng 254 nm và phun dung dịch FeCl3 5% trong methanol. Tiến hành: chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 20 µl mỗi dung dịch sau:
- Dung dịch chuẩn: lấy một ít tinh thể quercetin cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt methanol để hòa tan.
- Dung dịch thử: chiết 1 g cao Diếp cá với 20 ml CHCl3 bằng siêu âm. Lọc, cô cách thủy làm đậm đặc dịch chiết.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử như đã mô tả trong mục 2.2.5.2. Tiêm lần lượt các mẫu dung dịch chuẩn, dung dịch thử vào hệ thống HPLC, xác định diện tích đỉnh quercetin, rồi tính toán hàm lượng quercetin trong cao Diếp cá.
Hàm lượng phần trăm quercetin trong cao Diếp cá được tính theo công thức:
2 1 . . .100. % .100 . . .(100 ) c t t c C S m HLC X C S m a = −
Cc, Ct (µg/ ml): nồng đợ pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử Sc, St: diện tích đỉnh dung dịch chuẩn và dung dịch thử
m1 (g): khối lượng cao đem xử lý để được cắn chloroform. m2 (g): khối lượng cắn chloroform thu được
HLC: hàm lượng chuẩn đối chiếu quercetin a (%): độ ẩm
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU DIẾP CÁ 3.1.1. Mô tả
Thân hình trụ trịn hay dẹt, cong, dài 20-35 cm, đường kính 2-3 mm, mặt ngoài màu vàng nâu nhạt. Lá mọc so le hình tim, đầu lá nhọn, phiến lá gấp cuộn lại, nhàu nát, cuống lá dài chừng 2-3 cm, gốc cuống rộng thành bẹ mỏng. Mùi tanh cá. Vị hơi chát, se.
3.1.2. Vi phẫu
Biểu bì trên và dưới của lá gồm mợt lớp tế bào hình chữ nhật, xếp đều đặn, mang lông tiết đầu đơn bào chân đa bào và lơng che chở đa bào có xen lẫn tế bào tiết màu vàng ở mặt trên gân lá. Ở mặt dưới phiến lá có lỗ khí. Mơ mềm có tế bào màng mỏng và ít khuyết nhỏ. Bó libe – gỗ ở giữa gân lá gồm có bó gỗ ở trên, bó libe ở dưới. Mơ mềm phiến lá có những khuyết nhỏ và bó libe – gỗ nhỏ.
Bó libe-gỗ Lơng che chở Lỗ khí
Hình 3.1. Vi phẫu lá Diếp cá
3.1.3. Soi bợt
Biểu bì trên và biểu bì dưới gồm tế bào hình nhiều cạnh, thành hơi dày, mang tế bào tiết. Biểu bì dưới có lỗ khí. Tế bào tiết trịn, chứa tinh dầu màu vàng nhạt hay vàng nâu. Lỗ khí có 4 – 5 tế bào kèm nhỏ hơn. Lông che chở đa bào và tế bào tiết. Mảnh mạch xoắn. Giọt tinh dầu.
Tế bào tiết chứa tinh dầu Mạch xoắn Mạch mạng
Hình 3.2. Soi bột Diếp cá
Kết luận: đạt tiêu chuẩn DĐVN III
3.1.4. Định tính
Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại
Bợt và thân lá phát huỳnh quang màu nâu hung.
Phản ứng hóa học
Bảng 3.1. Định tính dược liệu Diếp cá
Phản ứng Thuốc thử Kết quả
A TT Bouchardat Tủa đỏ nâu (+)
B Quan sát ánh sáng tử ngoại Phát quang màu nâu hung (+) C dd acid fuchsin sulfureux Bợt ướt có màu hồng tím (+)
D Bột Mg + HClđđ Màu đỏ (+)
Kết luận: đạt tiêu chuẩn DĐVN III.
3.1.5. Độ ẩm
Bảng 3.2. Độ ẩm dược liệu Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Độ ẩm (%) 10,83 11,14 11,19 11,05
Kết luận: đạt tiêu chuẩn DĐVN III.
3.1.6. Tro toàn phần
Yêu cầu: không quá 14%.
Bảng 3.3. Tro toàn phần dược liệu Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Tro toàn phần (%) 11,54 10,77 11,25 11,18
Kết luận: đạt tiêu chuẩn DĐVN III.
3.1.7. Tạp chất
Yêu cầu: không quá 2%.
Bảng 3.4. Tạp chất dược liệu Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Tạp chất (%) 1,54 1,39 1,49 1,47
Kết luận: đạt tiêu chuẩn DĐVN III.
3.1.8. Tỷ lệ vụn nát
Yêu cầu: không quá 5%
Bảng 3.5. Tỷ lệ vụn nát dược liệu Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Kết luận: đạt tiêu chuẩn DĐVN III.
3.1.9. Định lượng tinh dầu
Yêu cầu: hàm lượng tinh dầu không ít hơn 0,08%
Bảng 3.6. Hàm lượng tinh dầu dược liệu Diếp cá
Số lần thực hiện 1 2 3 TB
Hàm lượng tinh dầu (%) 0,05 0,04 0,05 0,05
Kết luận: không đạt tiêu chuẩn DĐVN III.
Như vậy, dược liệu Diếp cá đạt yêu cầu tất cả các chỉ tiêu trong chuyên luận dược liệu Diếp cá DĐVN III, trừ định lượng tinh dầu là 0,05%.
3.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐINH LƯỢNG QUERCETIN TRONG CAO DIẾP CÁ
3.2.1. Quy trình chiết xuất cắn CHCl3 từ cao Diếp cá để định lượng quercetin
Sau khi thực hiện quy trình xử lý mẫu để định lượng quercetin trong cao Diếp cá theo Sơ đồ 2.2, các dịch chiết CHCl3 được tiến hành chấm SKLM, thu được kết quả theo Hình 3.3. Hệ dung mơi: toluene-chloroform-aceton (8:5:7) Vết chấm: C: quercetin chuẩn 1: Dịch chiết CHCl3 lần 1 2: Dịch chiết CHCl3 lần 2 3: Dịch chiết CHCl3 lần 3
Hình chụp khi phun
TT FeCl3 5% Hình chụp dưới UV254 nm
Hình 3.3. SKLM dịch chiết quercetin bằng CHCl3
Kết quả: đã chiết kiệt quercetin sau 3 lần chiết với CHCl3.
3.2.2. Thẩm định quy trình định lượng quercetin trong cao Diếp cá
3.2.2.1. Tính tương thích hệ thống
Kết quả thực nghiệm để đánh giá tính tương thích hệ thống của phương pháp HPLC định lượng quercetin trong cao Diếp cá được trình bày trong Bảng 3.7 và Bảng 3.8.
Bảng 3.7. Các thông số sắc ký của mẫu quercetin chuẩn
STT Thời gian lưu (tR) Diện tích đỉnh (S) Số đĩa lý thuyết (N)
1 5,925 8867983 2818 2 5,934 8962815 2867 3 5,94 8682189 2894 4 5,945 8787139 2905 5 5,937 8794014 2852 6 5,933 8767535 2829 TB 5,936 8810279,167 2860,833 SD 0,007 95531,241 34,684 RSD% 0,115 1,084 1,212
Bảng 3.8. Các thông số sắc ký của mẫu thử
STT Thời gian lưu (tR) Diện tích đỉnh (S) Số đĩa lý thuyết (N)
1 6,002 5583529 2258 2 6,015 5526160 2169 3 6,028 5493543 2193 4 6,02 5408291 2170 5 6,017 5469011 2215 6 5,97 5431377 2180 TB 6,009 5485318,5 2197,500
SD 0,021 64015,355 34,239
RSD % 0,345 1,167 1,558
Nhận xét: phương pháp HPLC đạt tính tương thích hệ thống.
3.2.2.2. Khảo sát tính tuyến tính
Kết quả khảo sát tính tuyến tính: đường chuẩn được xây dựng với 7 mẫu dung dịch chuẩn quercetin có nồng đợ tăng dần từ 25 – 300 µg/ml được trình bày trong
Bảng 3.9 và Hình 3.4.
Bảng 3.9. Sự tương quan giữa nồng đợ và diện tích đỉnh
Mẫu chuẩn Nồng đợ (µg/ml) Diện tích đỉnh
1 25 1235715 2 50 2657374 3 100 7810423 4 150 10862974 5 200 15007778 6 250 19615993 7 300 23150992
Hình 3.3. Sự liên quan giữa nồng đợ và diện tích đỉnh
Nhận xét: có sự liên quan tuyến tính giữa nồng đợ và diện tích đỉnh của quercetin
theo phương trình y = 80700x – 915890, R2 = 0,9977
Xử lý kết quả bằng phần mềm Ms-Excel với công cụ Regression Biện luận:
F = 2131,586 > F0,05 = 5,99: phương trình hồi quy tương thích Hệ số Bo = - 915890
to = - 2,9 < t0,05 = 2,447: hệ số Bo khơng có ý nghĩa thống kê Hệ số B = 80700
t = 46,169 > t0,05 = 2,447: hệ số B có ý nghĩa thống kê
Kết luận: có sự liên quan tuyến tính giữa nồng đợ và diện tích đỉnh của quercetin
trong khoảng 25-350 µg/ml, theo phương trình y = 80700x.
3.2.2.3. Khảo sát độ lặp lại
Kết quả khảo sát độ lặp lại được trình bày trong Bảng 3.10.
Bảng 3.10. Đợ lặp lại của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Mẫu Diện tích đỉnh Hàm lượng quercetin trong cao Diếp cá (%)
1 5583529 0,269 2 5526160 0,287 3 5493543 0,266 4 5408291 0,279 5 5469011 0,274 6 5431377 0,280
TB 0,276
SD 0,008
RSD% 2,801
Kết luận: RSD% = 2,801%, nên phương pháp định lượng quercetin bằng HPLC đạt
yêu cầu về độ độ lặp lại. 3.2.2.4. Khảo sát độ đúng
Kết quả thực nghiệm để đánh giá đợ đúng được trình bày trong Bảng 3.11.
Bảng 3.11. Độ đúng của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Mẫu Mức khảo sát Lượng thêm vào (mg) Lượng tìm thấy (mg) Tỷ lệ phục hồi (%) 1 80% 0,296 0,311 105,068 2 0,317 0,315 99,369 3 0,303 0,314 103,630 4 100% 0,412 0,427 103,641 5 0,405 0,402 99,259 6 0,418 0,425 101,675 7 120% 0,509 0,502 98,625 8 0,496 0,488 98,387 9 0,504 0,529 104,960 TB 101,62
Nhận xét: tỷ lệ phục hồi trung bình là 101,62% (nằm trong khoảng 98 – 102%),
RSD% = 2,72% . Do đó, phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng.
Kết luận: phương pháp đạt yêu cầu về tính tương thích hệ thống, độ tuyến tính, đợ
chính xác và đợ đúng.
3.3. TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO DIẾP CÁ3.3.1. Liên quan giữa điều kiện chiết xuất và kết quả thực nghiệm 3.3.1. Liên quan giữa điều kiện chiết xuất và kết quả thực nghiệm
Biến độc lập Biến phụ thuộc
x1 = độ cồn x2 = tỷ lệ DL/DM
y1 = hiệu suất chiết cao Diếp cá (%) y2 = hàm lượng quercetin (%)
x3 = số lần chiết
Bảng 3.12. Liên quan giữa điều kiện chiết xuất và kết quả thực nghiệm
x1 x2 x3 y1 y2 1 C 1/8 3 6,466 0,263 2 B 1/10 2 6,788 0,257 3 C 1/10 2 6,725 0,282 4 B 1/8 2 7,531 0,228 5 A 1/10 2 7,076 0,116 6 A 1/10 3 7,745 0,110 7 C 1/9 2 6,240 0,213 8 A 1/8 3 7,999 0,170 9 A 1/8 2 7,878 0,127 10 B 1/9 3 6,562 0,297 11 C 1/10 3 6,674 0,274 12 B 1/9 2 6,238 0,175 13 A 1/9 3 7,381 0,132 14 C 1/9 3 7,301 0,263
3.3.2. Liên quan nhân quả
Với đầu vào là dữ liệu thực nghiệm theo Bảng 3.12, phần mềm thông minh FormRules v3.3 (2007) với tùy chọn Minimum Description Length (MDL) đã phân tích mối liên quan nhân quả như sau:
Bảng 3.13. Liên quan nhân quả trong quy trình chiết xuất cao Diếp cá
x1 x2 x3 R2 luyện
y1 + + + 100
y2 + + + 100
Hiệu suất chiết và hàm lượng quercetin có liên quan trực tiếp với tất cả 3 yếu tố khảo sát là độ cồn, tỷ lệ DL/DM và số lần chiết.
Sự liên quan nhân quả nêu trên theo những qui luật sau đây:
Đối với hiệu suất chiết
Nếu x1 thấp thì y1 sẽ cao (1,00) Nếu x1 cao thì y1 sẽ thấp (0,57)