CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Phương pháp xử lý mẫu trà, cà phê
2.5.1. Hóa chất và thiết bị
a, Hóa chất
Tồn bộ hóa chất đều thuộc loại tinh khiết dùng trong phân tích sắc ký khí, bao gồm: - Diclometan, Merck, Đức
- Axeton, Merck, Đức - Cyclohexan, Merck, Đức - Muối NaCl, Merck, Đức
- Muối Na2SO4 khan, Merck, Đức - Bông thủy tinh
- Silicagel 60, Merck, Đức
- Dung dịch chuẩn gốc gồm 15 PAHs mix 63: acenaphthylen, acenaphthen, fluoren, phenanthren, anthracen, fluoranthen, pyren, benzo[a]anthracen, chrysen, benzo[b]fluoranthen, benzo[k]fluoranthen, benzo[a]pyren, indeno[1,2,3-cd]pyren, dibenz[a,h]anthracen, benzo[g,h,i]perylene nồng độ 1000 µg/ml pha trong dung mơi toluene, của hãng Dr. Ehrenstorfer, LGC, Đức.
- Chất đồng hành SR-PAH Mix 33 có nồng độ 2000 µg/ml gồm: acenaphthylen-d10, phenathren-d10, chrysen-d12, perylene-d12 trong toluene, của hãng Dr. Ehrenstorfer, LGC, Đức.
- Chất nội chuẩn (IS) pyrene-d10 có nồng độ 200 µg/ml trong isooctane,của hãng Dr. Ehrenstorfer, LGC, Đức.
- Nước đeion
b, Thiết bị
- Hệ thiết bị phân tích sắc ký khí ghép nối khối phổ GC-MS 2010 của hãng Shimadzu, Nhật Bản có các điều kiện phân tích như sau:
Cột tách BPX5 (đường kính cột: 0,25 mm; chiều dài cột: 60m, độ dày pha tĩnh 0,25 µm
Chế độ bơm mẫu chia dịng Thể tích bơm 2,0 µl
Thời gian bơm mẫu 1 phút Nhiệt độ cổng bơm mẫu 260 oC
Chương trình nhiệt độ: 60 oC (2 phút), tăng 210 oC (30 oC/phút), tăng 310 oC (15 phút) tốc độ 5 oC/phút
Khí mang là heli với tốc độ 1,5 ml/phút, điều kiện hoạt động của khối phổ: nhiệt độ nguồn ion 230 oC, nhiệt độ interface 300 oC, chế độ quan sát ion chọn lọc (SIM mode)
- Máy xay Philip
- Cân phân tích 4 số, Shimadzu, Nhật Bản - Hệ lọc nước deion Nanopure, Thermo, Mỹ - Máy lắc Vortex, IKA, Đức
- Máy lắc đứng, Nhật Bản - Máy lắc ngang, IKA, Đức
- Máy siêu âm Elma D-78224 Singen/HTW, Đức - Thiết bị cô cất quay chân không, Buchi, Thụy Sỹ - Hệ sắc ký thẩm thấu qua gel GPC, Eyela, Nhật Bản - Máy ly tâm Rotina 35R, Hetteic Zentrifugen, Đức - Bộ cô mẫu nitơ N-EVAP, Nhật Bản
- Phễu thủy tinh 1 L
- Lọ thủy tinh có nắp 40 mL - Bình cầu 250 mL
- Ống đong 100, 250 mL - Cốc thủy tinh 50, 100 mL
- Ống nghiệm thủy tinh chia vạch 15 mL - Lọ 2 mL, nắp, septa
- Pipet paster
- Pipet tự động 100, 1000, 5000 µL
2.5.2. Xử lý mẫu
a, Quy trình xử lý mẫu trà khơ
Mẫu trà xanh và trà ô long sau khi mua về được xay nhỏ cỡ 0,5 mm bằng máy xay rồi trộn đều. Đối với mẫu trà đen ở dạng túi lọc bỏ phần túi gói rồi trộn đều mẫu. Sau đó, lấy một phần mẫu (khoảng 5 g) đem sấy ở nhiệt độ 105 oC để xác định độ ẩm. Mẫu được bảo quản trong tủ sạch, khô ráo và tránh ánh sáng mặt trời ở nhiệt độ phịng.
Hình 2.1. Quy trình xử lý mẫu trà khơ
b, Quy trình xử lý mẫu nước trà pha
Mẫu trà sau khi trộn đều, cân 20 g pha với 200 ml nước sôi ở 100 oC theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Sau đó, lấy 10 ml nước trà pha cho vào phễu chiết 1 l. Thêm 25 µl hỗn hợp chất đồng hành (1ppm) và 50 ml diclometan (DCM), lắc phễu chiết bằng máy lắc đứng ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Chuyển lớp dung dịch trên vào cốc thủy tinh 100 ml. Quá trình này được lặp lại trong hai lần. Lớp dung dịch trên được lọc qua muối Na2SO4, trước khi cho vào bình cầu 250 ml. Cơ dịch chiết đến 2 ml bằng thiết bị cơ quay chân khơng.
c, Quy trình xử lý mẫu cà phê rang và cà phê hòa tan
Mẫu cà phê rang và cà phê hịa tan được bỏ phần túi gói rồi trộn đều mẫu. Sau
đó, lấy một phần mẫu (khoảng 5 g) đem sấy ở nhiệt độ 105 oC để xác định độ ẩm. Mẫu được bảo quản trong tủ sạch, khô ráo và tránh ánh sáng mặt trời ở nhiệt độ phịng.
Sau đó mẫu được xử lý theo quy trình được mơ tả trong hình 2.2.
Hình 2.2. Quy trình xử lý mẫu cà phê rang và cà phê hịa tan
d, Quy trình xử lý mẫu nước cà phê rang
Pha 20 g cà phê rang với 100 ml nước 100 0C theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, lấy 10 ml nước cà phê pha phin cho vào phễu chiết 1 l. Thêm 25 µl SR Mix (1 ppm) và 20 ml KOH 20 % rồi lắc phiễu chiết bằng máy lắc đứng ở nhiệt độ phịng trong 20 phút. Sau đó, thêm tiếp vào phễu chiết 50 ml DCM, tiếp tục lắc phễu chiết bằng máy lắc đứng ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Chuyển lớp dung dịch trên vào cốc thủy tinh 100 ml. Quá trình này được lặp lại trong hai lần. Tất cả các chất chiết được cho lại vào phễu chiết 1 l và thêm 20 ml NaCl 5 % để rửa lượng kiềm còn dư,
phễu chiết được lắc bằng máy lắc đứng ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Lớp dung dịch trên được lọc qua muối Na2SO4, trước khi cho vào bình cầu 250 ml. Cô dịch chiết đến 2 ml bằng thiết bị cô quay chân không.
Dịch chiết được làm sạch tương tự như mẫu cà phê rang và mẫu cà phê hòa tan. 2.6. Phân tích sắc ký khí khổi phổ (GC/MS)
Các điều kiện phân tích PAHs trên thiết bị GC-MS được lấy từ quy trình đã được chuẩn hóa cho phân tích các hợp chất PAHs tại Trung Tâm Nghiên Cứu Môi Trường và Phát Triển Bền Vững (CETASD). Các điều kiện chi tiết phân tích PAHs bằng thiết bị GC-MS được tình bày dưới đây:
Hiện nay, có nhiều phương pháp có thể sử dụng để phân tích các hợp chất hữu cơ như: phổ cộng hưởng từ hạt nhân, sắc ký, tinh thể học, phổ hồng ngoại. Trong đó, phương pháp sắc ký là phương pháp tối ưu và hiện đại nhất.
Sắc ký khí là q trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc lỏng và pha động là chất khí. Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng pha khí. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hố của các chất khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
Hình 2.3. Thiết bị GC-MS 2010, Shimadzu
Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc ký khí là hệ thống cột tách và detector [3].
Nguyên lý hoạt động của thiết bị sắc ký khí là: mẫu từ buồng bay hơi được khí mang ở trong bom khí dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký xảy ra tại đây. Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này được khuếch đại rồi chuyển sang bộ ghi hoặc máy tính. Các tín hiệu được xử lý rồi chuyển sang bộ phận in và lưu kết quả.
Hình 2.4 trình bày sơ đồ các bộ phận cơ bản của một thiết bị sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS).
Hình 2.4. Sơ đồ hệ thiết bị GC/MS
2.6.1. Pha chất chuẩn a) Chuẩn bị chất chuẩn
• Dung dịch chuẩn PAH Mix 63: nồng độ 100 ppb và 1 ppm được pha lỗng từ nồng độ gốc 1000 ppm.
• Dung dịch hỗn hợp chất đồng hành (SR): nồng độ 100 ppb và 1 ppm được pha loãng từ nồng độ gốc 2000 ppm và 10 ppm.
• Dung dịch nội chuẩn (IS): nồng độ 1ppm được pha lỗng từ nồng độ gốc 200 ppm.
• Dung môi sử dụng để pha chuẩn là Cyclohexan, loại tinh khiết cho sắc ký.
b) Cách pha dãy dung dịch chuẩn
Đường chuẩn của 15 PAHs được xác định theo phương pháp nội chuẩn, dựa vào tỉ lệ nồng độ chất chuẩn với chất nội chuẩn và tỉ lệ giữa diện tích pic của chất chuẩn với chất nội chuẩn. Đường chuẩn được xây dựng với 7 điểm chuẩn trong khoảng nồng độ từ 1 đến 200 ng/ml, nồng độ chất nội chuẩn (IS) là 100 ng/ml. Hệ số tương quan của các đường chuẩn R2 đạt giá trị từ 0,9997 đến 1.
Cách pha dãy chuẩn được trình bày trong bảng 2.1
Bảng 2.1. Nồng độ các điểm chuẩn và cách pha
Kí hiệu Nồng độ(ng/ml) STD mix 63 (100 ppb) L STD mix 63 (1000 ppb) L IS:Pyren- d10 (1 ppm) L VCyclohexan L QC 1 1 20 200 1780 QC 2 5 100 200 1700 QC 3 10 20 200 1780 QC 4 20 40 200 1760 QC 5 50 100 200 1700 QC 6 100 200 200 1600 QC 7 200 400 200 1400
2.6.2. Điều kiện chạy máy GC
• Cột BPX5: chiều dài 60 m, ng kớnh 0,25 mm, dy pha tnh 0,25 àm
ã Chế độ bơm mẫu là chia dòng
ã Th tớch bm 2,0 àL
• Thời gian bơm mẫu 1 phút
• Nhiệt độ cổng bơm mẫu 260 oC
• Chương trình nhiệt độ: 60 oC giữ trong 2 phút, tăng 210 oC với tốc độ 30 oC/phút, tiếp tục tăng đến 310 oC với tốc độ 5 oC/phút và giữ tại 310 o C trong 15 phút.
• Khí mang là heli với tốc độ 1,5 ml/phút
2.6.3. Điều kiện chạy máy MS
• Nhiệt độ nguồn ion 230oC
• Nhiệt độ interface 300oC
• Chế độ quan sát ion chọn lọc (SIM mode)
Bảng 2.2. Thời gian lưu và mảnh phổ đặc trưng của các cấu tử PAHs
Thứ tự PAHs Thời gian
lưu(phút) Mảnh định lượng (m/z) Mảnh so sánh (m/z) 1 ACY 10,109 152 151 2 ACN -d10 10,273 164 165 3 ACN 10,321 154 153 4 FLR 11,131 166 165 5 PHE-d10 13,127 188 154 6 PHE 13,185 178 176 7 ANT 13,315 178 179 8 FLA 16,746 202 101 9 PR-d10(IS) 17,540 212 202 10 PR 17,608 202 101 11 BaA 22,580 228 114 12 CHR-d12 22,467 240 236 13 CHR 22,412 228 114 14 BbF 26,983 252 250; 253 15 BkF 27,091 252 253; 250 16 BaP 28,428 252 250; 253 17 PYR-d12 28,695 264 260 18 IP 34,196 276 277 19 DahA 34,255 278 276 20 BghiP 35,935 276 275; 277 Nguồn: CETASD
Hình 2.5. Sắc đồ của dung dịch chuẩn nồng độ 200 ppb 2.6.4. Các thông số đánh giá độ tin cậy của phương pháp
a) Độ đúng (hiệu suất thu hồi) của phương pháp
Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và giá trị quy chiếu được chấp nhận. Do đó, thước đo độ đúng thường đánh giá qua sai số tương đối hay xác định hiệu suất thu hồi.
Hiệu suất thu hồi là cách khác để biểu diễn độ chệch dưới dạng phần trăm tương đối của lượng tìm lại được. Để xác định hiệu suất thu hồi ta thêm một lượng chất đã biết chính xác nồng độ vào nền mẫu trước khi xử lí. Sau khi xử lí và phân tích thu được nồng độ chất và từ đó xác định được hiệu suất thu hồi.
b) Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích cịn cho tín hiệu phân tích có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền. Trong luận văn này, ta có LOD được tính bằng 3 lần độ lệch chuẩn (SD) của nồng độ PAHs nhỏ nhất.
Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được tín hiệu phân tích có ý nghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền. LOQ chỉ áp dụng cho các phép định lượng. Trong luận văn này, LOQ được tính bằng 10 lần độ lệch chuẩn (SD) của nồng độ nhỏ nhất.
Để kiểm soát chất lượng của q trình phân tích, chất đồng hành ln được thêm vào từng mẫu trước khi mẫu được chuẩn bị. Mẫu trắng, mẫu lặp và mẫu thu hồi (thêm chuẩn PAHs) luôn được thực hiện trong mỗi mẻ mẫu. Hiệu suất thu hồi của 15 PAHs đạt từ 54 – 104 % đối với mẫu trà và đạt từ 52 – 98 % đối với mẫu cà phê. Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL) được xác định bằng thí nghiệm thêm PAH chuẩn có nồng độ cao hơn giới hạn phát hiện trên máy (IDL) 10 lần, vào nền mẫu trà và cà phê, thực hiện q trình phân tích như trên 5 lần. Giới hạn phát hiện (LOD) trong các mẫu trà và cà phê tương ứng là 0,03 – 0,08 µg/kg và 0,03 – 0,06 µg/kg.
2.6.5. Tính tốn PAHs trong trà và cà phê
Hàm lượng PAHs trong mẫu trà và cà phê được xác định bằng công thức:
CPAH/GC (ng/ml) x HQC x Hdil x Vext (ml) CPAHs ( g/kg) = -----------------------------------------------------
Trong đó:
CPAH ( g/kg): Nồng độ PAH trong mẫu thật
CPAH/GC (ng/ml) : Nồng độ PAH trong dịch chiết cuối cùng bơm lên GC HQC: Hệ số chuẩn QC bơm trong dãy mẫu
Hdil : Hệ số pha loãng (nếu mẫu được pha loãng khi bơm) Vext : Thể tích dịch chiết cuối cùng
HSR: Hiệu suất của chất đồng hành
Wmẫu (g): Khối lượng mẫu khơ tính được từ hàm ẩm của mẫu (2)
Hàm ẩm được xác định theo công thức (1)
WS (g) – WDS (g)
H (%) = ------------------------------ x 100 (1) WS (g)
Trong đó:
H(%): Hàm lượng nước trong mẫu WS (g): Khối lượng mẫu ban đầu WDS (g): Khối lượng mẫu sau khi sấy
Sau khi xác định được độ ẩm tính được khối lượng mẫu chiết qui về mẫu khô, theo công thức (2):
(100 – H% )
W mẫu (g) = W (g) x -------------------- (2) 100
W mẫu (g) : Khối lượng mẫu được chiết tính theo khối lượng khơ W (g) : Khối lượng mẫu được chiết ban đầu
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN3.1. Kết quả khảo sát khu vực nghiên cứu 3.1. Kết quả khảo sát khu vực nghiên cứu
Trà ở Việt Nam là đồ uống phổ biến thứ hai chỉ sau nước. Trà Việt Nam được trồng nhiều ở vùng trung du và miền núi phía bắc do điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu phù hợp. Trong đó, với diện tích gần 20.000 ha trồng trà, Thái Nguyên là một trong những tỉnh đứng đầu cả nước về diện tích canh tác cây trà, bên cạnh đó Yên Bái và Tuyên Quang cũng là những vùng trồng trà với số lượng lớn. Do có nhiều vùng trồng trà khác nhau, mà các thương hiệu trà Việt Nam cũng rất đa dạng và phong phú. Có thể kể đến một số thương hiệu như: Tân Cương, Đại Gia, Thái Nguyên, Tâm Châu,…
Việt Nam hiện là một trong những nước có lượng xuất khẩu cà phê lớn nhất thế giới. Theo báo cáo, tổng sản lượng cà phê Việt Nam năm 2016 là 1,76 triệu tấn và có 90 - 95 % trong số đó được xuất khẩu [28].
Khi nhắc đến cà phê Việt Nam, cà phê Tây nguyên là địa danh trồng cà phê nổi tiếng nhất. Dải đất Tây nguyên với phần lớn là loại đất đỏ bazan, có tính chất cơ lý tốt, khả năng giữ nước và hấp thu dinh dưỡng cao, kết cấu viên có độ xốp bình qn 62 – 65 %. Bên cạnh đó, Tây nguyên Việt Nam phần lớn là các cao nguyên có độ cao khoảng 500 – 600 m so với mực nước biển, có khí hậu mát mẻ, mưa nhiều nên rất thích hợp với cây cà phê. Tuy chỉ có một số vùng trồng cà phê nhất định, nhưng các thương hiệu chế biến cà phê thành phẩm ở Việt Nam lại rất đa dạng, có thể kể đến một số thương hiệu nổi tiếng như: Trung Nguyên, Highland, Phúc Long, Mê Trang, Mai café, … Mỗi thương hiệu này lại có các cách chế biến cà phê khác nhau, tạo ra các dịng sản phẩm cà phê có hương thơm và mùi vị khác nhau.
Qua khảo sát thực tế thị trường cà phê và thị hiếu người tiêu dùng Việt Nam, tác