Dung dịch đệm axetat 0.1M: hòa tan 28,5ml axit axetic và 41g natri axetat trong nước cất và định mức bằng nước cất thành 500ml
Complexon III 0,025M: hòa tan 4,65g complexon III trong nước cất và định mức bằng nước cất thành 500ml
Dung dịch KSCN 0,1M: hòa tan 4,85g KSCN trong nước cất và định mức bằng nước cất thành 500ml
Dung dịch NH3 5%: cho 100ml NH3 đặc vào bình định mức 500ml và định mức bằng nước cất đến vạch
Pha đithizon:
Cân 10mg đithizon và 20ml CHCl3 cho vào phễu chiết lắc kỹ cho tan hết (hình 2.1a ).
Thêm vào 20ml nước cất và 1 đến 2ml NH3 đặc lắc kỹ khoảng 2 phút, để yên cho hai tướng phân lớp, bỏ lớp phía trên (hình 2 1b )
Cho tiếp 4ml CHCl3 lắc đều, để yên cho phân lớp, bỏ lớp CHCl3 (hình 2.1c) Cho thêm 40ml CHCl3 và thêm dần axit HCl (1: 5) đến phản ứng axit rõ (pH = 4 ÷ 5), lắc đều hỗn hợp để toàn bộ đithizon chuyển sang tướng hữu cơ (hình 2.1d).
Chuyển tướng hữu cơ sang một phễu chiết khác rửa ba lần bằng nước cất mỗi lần 10ml (hình 2 1e)
Chuyển sang chai nâu sẫm, đổ trên bề mặt một lớp mỏng H2SO4 0 5% chứa 0.5% hiđrazinsunfat. Dung dịch này bền trong vài tháng
(a) (b) (c) (d) (e)
Hình 2.1. Màu sắc của dung dịch trong quá trình pha chế đithizon
Đithizon dùng để chiết: lấy một thể tích dung dịch gốc trộn với 4 thể tích CHCl3 để trong chai nâu sẫm ở chỗ mát Dung dịch chỉ bền trong 2 tuần
2.3. Nội dung cần nghiên cứu
- Nghiên cứu các điều kiện tối ưu xác định tổng hàm lượng thủy ngân trong nghêu, sò và vẹm bằng phương pháp chiết trắc quang đithizon
- Xây dựng đường chuẩn xác định thủy ngân - Xác định hiệu suất thu hồi của phương pháp - Xác định sai số thống kê của phương pháp
- Xây dựng quy trình phân tích tổng hàm lượng thủy ngân trong nghêu, vẹm và sò bằng phương pháp chiết trắc quang đithizon.
- Áp dụng quy trình phân tích một số mẫu nghêu, sò và vẹm ở bờ biển Đà Nẵng
2.4. Thực nghiệm nghiên cứu các điều kiện tối ƣu vô cơ hóa mẫu 2.4.1. Quy trình vô cơ hóa mẫu
Thông qua tìm hiểu tài liệu và để thực hiện vô cơ hóa mẫu phù hợp với phòng thí nghiệm, chúng tôi sử dụng phương pháp vô cơ hóa mẫu ướt Sơ đồ quy trình vô cơ hóa mẫu được đề nghị như hình 2 2
+ Để nguội.
Cân chính xác 5g mẫu đã xay nhuyễn vào bình cầu
Dung dịch phân tích Dung dịch trong
+ HNO3 đặc + H2SO4 đặc + HClO4 đặc
+ Lắp vào ống sinh hàn hồi lƣu và đun trên bếp điện.
2.4.2. Khảo sát thể tích hỗn hợp dung môi
Trên cơ sở nghiên cứu các tài liệu [7, 16] và đặc điểm của mẫu nghêu, sò và vẹm chúng tôi chọn hỗn hợp dung môi HNO3 đậm đặc, H2SO4 đậm đặc và HClO4 để vô cơ hóa mẫu theo phương pháp ướt Do mẫu nhuyễn thể khó phân hủy nên chúng tôi thay đổi thể tích H2SO4 đậm đặc nhằm giảm thời gian đun mẫu
Chuẩn bị 4 mẫu sò lông (mỗi mẫu 5g) đã xay nhuyễn cho vào bình cầu Mẫu 1: thêm 10ml axit HNO3 đậm đặc + 2ml H2SO4 + 2ml HClO4 (M1). Mẫu 2: thêm 10ml axit HNO3 đậm đặc + 3ml H2SO4 + 2ml HClO4 (M2). Mẫu 3: thêm 10ml HNO3 đậm đặc + 4ml H2SO4 + 2ml HClO4 (M3). Mẫu 4: thêm 10ml HNO3 đậm đặc + 5ml H2SO4 + 2ml HClO4 (M4). Mẫu 5: thêm 10ml HNO3 đậm đặc + 6ml H2SO4 + 2ml HClO4 (M5).
Lắp ống sinh hàn, đun trên bếp điện đến khi dung dịch trong suốt, để nguội. Tiến hành phân tích và đo mật độ quang ở bước sóng 490nm
Từ đó chọn thể tích dung môi tối ưu
2.4.3. Khảo sát thời gian đun mẫu
Sau khi chọn được thể tích dung môi thích hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian đun để thu được dung dịch trong suốt Thời gian đun mỗi mẫu là: 25 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút, 60 phút. Tiến hành phân tích và đo mật độ quang ở bước sóng 490nm. Từ đó chọn thời gian đun mẫu tối ưu
2.5. Thực nghiệm nghiên cứu các điều kiện tối ƣu xác định tổng hàm lƣợng thủy ngân trong nghêu, sò và vẹm bằng phƣơng pháp chiết trắc quang đithizon 2.5.1. Quy trình chiết thủy ngân
Mẫu sau khi vô cơ hóa thì tiến hành chiết trắc quang đithizon theo tiêu chuẩn TCVN 4580 – 88 [11].
Quy trình chiết thủy ngân theo TCVN 4580-88: Cho vào phễu chiết phần dung dịch sau khi vô cơ hóa mẫu, thêm vào 10ml CHCl3, lắc kỹ để phân lớp Tách bỏ lớp CHCl3. Thêm 10ml dung dịch đệm, 10ml complexon III 0.025M, 10ml KSCN 0 1M và 25ml đithizon để chiết Tiến hành chiết trong 2 phút, chỉ cần lắc vừa phải đủ để phân lớp Chuyển tướng hữu cơ sang một phễu chiết thứ hai đã có
sẵn 10ml dung dịch đệm, 10ml complexon III 0 025M, 10ml KSCN 0 1M, 10ml nước cất Khi chuyển không để cho nước từ phễu thứ nhất chuyển sang phễu thứ hai dù chỉ vài giọt Lắc trong vòng một phút để phân lớp Sau đó, chuyển tướng hữu cơ chứa phức thủy ngân đithizonat sang phễu chiết thứ ba chứa sẵn 50ml NH3 5% Lắc đều để rửa hết lượng đithizon còn dư lại Chuẩn bị một phễu lọc sạch, khô, có sẵn giấy lọc khô và lọc tướng hữu cơ của thủy ngân đithizonat qua phễu Lượng dung dịch ban đầu chảy xuống cần bỏ đi, thu dung dịch cần đo vào cuvet Đo mật độ quang của dung dịch thu được ở bước sóng λmax = 490nm, so với mẫu trắng Mẫu trắng được chuẩn bị tương tự như mẫu thật nhưng không có mặt của thủy ngân tức là mẫu dung dịch sau khi vô cơ hóa được thay bằng nước cất hai lần
Theo [10] thì phức thủy ngân đithizonat có màu rất bền, thời gian ổn định màu là trong vòng 150 phút Do vậy có thể đo mật độ quang trong khoảng thời gian 150 phút sau khi chiết
Qua tham khảo tài liệu [6] thì phản ứng giữa Hg2+
với đithizon bị cản trở bởi Ag+ và Cu2+ vì chúng phản ứng với thuốc thử tạo thành hợp chất có màu tương tự Do vậy để loại trừ Ag+
và Cu2+ chúng tôi dùng các chất che là 10ml dung dịch complexon III (H2Y2-) 0 025 M và 10ml dung dịch KSCN 0 1M Do lượng thừa complexon III và KCN không ảnh hưởng đến mật độ quang của phức màu, nên để loại trừ triệt để chúng tôi thêm các chất che vào 2 giai đoạn chiết
Để tìm điều kiện tối ưu cho quy trình chiết nhằm phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm, đạt độ nhạy cao nhất mà lại tiết kiệm được dung môi và hóa chất chúng tôi tiến hành khảo sát thể tích đithizon để chiết, thời gian chiết và thể tích NH3 5% tối đa để rửa.
2.5.2. Khảo sát thể tích đithizon dùng để chiết
Mục đích của thí nghiệm này là tìm ra thể tích đithizon nhỏ nhất mà vẫn đạt được mật độ quang cao nhất
Để thực hiện quá trình này, chúng tôi chuẩn bị 5 mẫu sò lông, mỗi mẫu 5g. Tiến hành vô cơ hóa mẫu theo quy trình ở mục 2 4 1 với dung môi chọn theo mục 2.4.2 và thời gian đun theo mục 2.4.3, sau đó chiết thủy ngân theo quy trình 2.5.1, thể tích đithizon thay đổi lần lượt 10ml, 15ml, 20ml, 25ml, 30ml. Tiến hành đo mật
độ quang của phức thủy ngân đithizonat chiết được ở bước sóng 490nm. Tìm thể tích đithizon chiết tối ưu
2.5.3. Khảo sát thời gian chiết
Qua việc tham khảo tài liệu [1, 4] cho thấy cường độ màu của phức thủy ngân đithizonat phụ thuộc vào thời gian chiết vì vậy sau khi chọn được thể tích đithizon tối ưu, chúng tôi tiến hành khảo sát chọn thời gian chiết ngắn nhất mà vẫn đạt được mật độ quang cao nhất
Tương tự như trường hợp khảo sát thể tích đithizon chiết , chúng tôi thực hiện các bước vô cơ hóa mẫu và chiết đối với 5 mẫu sò lông, mỗi mẫu 5g, thể tích đithizon được chọn theo mục 2 5 2, thời gian chiết thay đổi theo trình tự 0 5 phút, 1 phút, 2 phút, 2 5 phút và 3 phút Đo mật độ quang ở bước sóng λmax= 490nm. Tìm thời gian chiết tối ưu
2.5.4. Khảo sát thể tích NH3 5% tối đa để rửa đithizon dƣ
Sau khi chọn được thể tích đithizon thích hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát chọn thể tích NH3 5% tối đa để rửa đithizon dư
Trên cở sở nghiên cứu tài liệu [1] và [4] dung dịch rửa có thể là dung dịch NH3 5%, hoặc NaOH 0 2N, chúng tôi chọn dung dịch rửa là NH3 5%.
Để thực hiện quá trình này, chúng tôi tiến hành chuẩn bị 6 mẫu nghêu lụa, mỗi mẫu 5g Tiến hành vô cơ hóa mẫu theo quy trình ở mục 2 4.1 với các điều kiện đã khảo sát ở mục 2 4.2 và 2.4.3, sau đó chiết thủy ngân theo quy trình 2 5.1 với thể tích đithizon chọn theo mục 2.5.2 và thời gian chiết theo mục 2 5 3, thể tích NH3 5% thay đổi lần lượt là: 25ml, 30ml, 40ml, 50ml, 55ml và 60ml. Tiến hành đo mật độ quang của phức thủy ngân đithizonat chiết được ở bước sóng 490nm Tìm thể tích NH3 5% tối đa để rửa tối ưu nhất
2.6. Xây dựng đƣờng chuẩn xác định thủy ngân
Qua tham khảo tài liệu [6] cho biết giới hạn nồng độ phát hiện của Hg2+ là 10-6 ppm và khoảng nồng độ tuyến tính của thủy ngân là 10-6 ppm ÷ 3.10-1 ppm.
Pha một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ Hg2+
tăng dần và nằm trong khoảng tuyến tính Tiến hành chiết Hg2+
theo quy trình 2.5.1, thể tích đithizon được chọn ở mục 2 5.2, thời gian chiết theo mục 2 5 3 và thể tích NH3 5% được chọn ở
mục 2.5.4. Đo mật độ quang của phức thủy ngân đithizon đã chiết được so với mẫu trắng Lập đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ của Hg2+
và xây dựng đường chuẩn
2.7. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp
Để xác định hiệu suất thu hồi của phương pháp ta tiến hành phân tích trên 5 mẫu giả với nồng độ ban đầu của Hg2+
đã biết chính xác Thực hiện quá trình vô cơ hóa mẫu theo mục 2 4 1 rồi chiết trắc quang và sử dụng các điều kiện tối ưu đã khảo sát ở mục 2 5, sau đó đo mật độ quang của phức thủy ngân đithizonat ở bước sóng λmax= 490nm Từ đó đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp
2.8. Đánh giá sai số thống kê của phƣơng pháp
Thực tế, trong quá trình ta phân tích luôn mắc phải các sai số trong quá trình cân, đo thể tích cũng như trong các giai đoạn phân tích Điều đó sẽ quyết định độ chính xác của phép phân tích
Thông thường, khi tiến hành thí nghiệm chúng ta thường tiến hành một số thí nghiệm độc lập trong cùng điều kiện giống nhau, và từ các kết quả riêng lẻ thu được, ta tiến hành xử lí thống kê để đánh giá độ chính xác của phép đo Các đại lượng đặc trưng thống kê quan trọng nhất là giá trị trung bình cộng và phương sai.
Giá trị trung bình cộng
Giả sử ta tiến hành n phép đo độc lập đại lượng X với các kết quả
1; 2; 3... n X X X X Giá trị trung bình cộng 1 n i i X X n
là giá trị gần với giá trị thực của đại lượng cần đo với xác suất cao nhất trong số các giá trị đo được
Phương sai
Phương sai của phép đo phản ánh độ phân tán của kết quả đo, được đánh giá bằng: 2 2 1 ( ) n i i X X S k
Giá trị 2
s s thường được gọi là độ lệch chuẩn của phép đo Độ lệch chuẩn của đại lượng trung bình cộng sX được tính theo:
2 2 ( ) ( 1) i x X X s S n n n Hệ số biến động Cv
Đặc trưng cho độ lặp lại hay độ phân tán của các kết quả thí nghiệm và được xác định bằng hệ thức:
Cv S 100%
X
Cv càng nhỏ độ lặp lại càng tốt
Biên giới tin cậy
Biên giới tin cậy (độ chính xác) ε là giá trị tuyệt đối của hiệu giữa giá trị trung bình cộng X và giá trị thực của đại lượng phải đo:
X
Trong thực tế được đánh giá ứng với một độ tin cậy α đã cho, ví dụ = 0,95 (95%) hoặc = 0,99 (99%) ...
ε được tính theo: S tX ,k
,k
t = hệ số Student ứng với số bậc tự do k của phép đo và độ tin cậy α đã
cho.
Khoảng tin cậy của giá trị đo là khoảng tại đó có khả năng tồn tại giá trị thực của phép đo với xác suất α đã cho
X X hay X S tX ,k X S tX ,k
Sai số tương đối ∆%
Sai số tương đối ∆% dùng để đánh giá sự chính xác của phương pháp được tính theo công thức: % 100 % X
Để đánh giá sai số thống kê, ta tiến hành phân tích trên 2 mẫu giả, mỗi mẫu 50ml Hg2+ đã biết chính xác nồng độ Tiến hành chiết thủy ngân và sử dụng các điều kiện tối ưu đã khảo sát ở mục 2 5 Mỗi mẫu làm 5 lần Từ đó tính sai số thống kê của phương pháp
2.9. Quy trình phân tích thủy ngân trong nghêu, sò và vẹm
Trên cơ sở kết quả khảo sát các điều kiện tối ưu để vô cơ hóa mẫu và xác định thủy ngân trong nghêu, sò và vẹm như ở mục 2.4 và 2.5, chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình phân tích thủy ngân trong nghêu, sò và vẹm bằng phương pháp chiết trắc quang đithizon Áp dụng quy trình này chúng tôi tiến hành phân tích hàm lượng thủy ngân trong một số loài nghêu, sò và vẹm thuộc bờ biển thành phố Đà Nẵng
2.10. Phân tích đánh giá tổng hàm lƣợng thủy ngân trong một số loài nghêu, sò và vẹm thuộc bờ biển Đà Nẵng
2.10.1. Địa điểm lấy mẫu
Dọc bờ biển Nam Ô, Thanh Bình, Sơn Trà ngay sau khi đánh bắt
2.10.2. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu [12, 16, 24]
Lấy mẫu: Ta tiến hành thu thập mẫu theo kiểu ngẫu nhiên ngay sau khi đánh bắt dọc bờ biển khu vực Đà Nẵng Mẫu được mua từ nhiều điểm bán với nhiều kích thước gần giống nhau sau đó đồng nhất thành mẫu ban đầu
Chuẩn bị mẫu: Việc thu thập mẫu phải đảm bảo mẫu được tươi nên sau khi
lấy nếu ở gần thì chuyển ngay về phòng thí nghiệm và tiến hành xử lý sơ bộ ngay Nếu ở xa phòng thí nghiệm thì phủ bùn và bảo quản chỗ mát (theo kinh nghiệm của ngư dân, bằng cách này có thể giữ cho nhuyễn thể tươi trong một tuần) Mẫu được chuyển về phòng thí nghiệm, tại đây các chất bẩn bám ngoài vỏ được rửa sạch rồi cạo sạch phần bẩn bằng một con dao inốc sạch Rửa sạch vỏ ngoài bằng nước cất hoặc nước biển rồi để ráo Tiếp theo dùng lưỡi dao ấn vào phía ngoài của cơ khép vỏ rồi chuyển lưỡi dao sau đó lách một đường thẳng để tách hai vỏ ra, nếu hai cơ khép được cắt ra thì hai vỏ được mở ra dễ dàng Không cố gắng mở hai vỏ bằng cách đập vỡ vỏ vì như thế vỏ và các chất bẩn sẽ dính vào phần thịt của nhuyễn thể làm bẩn mẫu Dùng con dao nhựa lấy phần thịt của nhuyễn thể ra và chú ý là không được
chạm vào vỏ Tiếp đó để ráo nước và đem xay nhỏ bằng máy xay sinh tố hoặc cối xay Sau đó cân rồi tiến hành phân tích, nếu chưa phân tích được ngay thì bảo quản trong tủ lạnh ở -40C hoặc cho lượng dung môi đã khảo sát vào để ngâm ngày hôm sau tiến hành quá trình vô cơ hóa mẫu
Mẫu được xác định rõ ràng: địa điểm lấy mẫu, ngày lấy mẫu, tên mẫu, kích thước.
2.10.3. Phân tích mẫu
Áp dụng điều kiện tối ưu đã khảo sát và tiến hành phân tích hàm lượng thủy ngân trong nghêu, sò và vẹm theo quy trình đề xuất ở mục 2 9