M Ở ĐẦU
2.2.Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu
2. ĐỐ IT ƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu
2.2.1. Dụng cụ
- Typ lấy máu chống đông EDTA. - Pipet, đầu côn các loại.
- Ống Eppendorf 1,5 mL, ống Falcon.
-Tủ lạnh sâu -30°C và -80°C (SANYO, Nhật). -Máy điện di Mupid (Nhật).
-Máy soi gel và chụp ảnh tự động Chemidoc EQ-Bio-Rad (Hoa Kỳ). - Máy ly tâm lạnh Beckman (Hoa Kỳ) và ly tâm để bàn Eppendorf (Đức). -Lò vi sóng (Samsung).
-Tủ nuôi cấy có chế độ lắc.
-Máy đọc trình tự gen ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Hoa Kỳ).
-Tủ ấm.
2.2.2. Hoá chất
* Hóa chất dùng để tách chiết DNA: - Dung dịch lysis buffer
- Dung dịch K
- Dung dịch SDS 10% - Proteinase K (10mg/mL)
- Dung dịch phenol: chloroform : isoamyl với tỷ lệ 25 : 24 : 1 - Dung dịch chloroform : isoamyl với tỷ lệ 24 : 1
- Ethanol 100% và ethanol 70% - Sodium acetate 3M, pH=5,2
- Dung dịch hòa tan DNA để bảo quản DNA sau khi tách:
Dung dịch Lysis buffer
Hoá chất Nồng độ Thể tích (mL)
Sucrose 0,3 M 51,3
Trixton X-100 1% (v/v) 5
Chỉnh pH=7,5 bằng HCl, hoàn thành bằng nước cất hai lần vừa đủ 500 mL.
Dung dịch K
Hoá chất Nồng độ Thể tích (mL)
NaCl 0,075 M 0,8775 g
EDTA 0,024M 1,7868 g
Chỉnh pH=8,0 bằng NaOH, hoàn thành bằng nước cất hai lần vừa đủ 200 mL.
* Hoá chất để thực hiện Kỹ thuật PCR (Invitrogen):
+ 10x buffer
+ dNTP 10mM
+ Taq polymerase
+ Các cặp mồi (xuôi và ngược)
* Hoá chất đểđiện di sản phẩm PCR trên gel agarose: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Agarose
+ Dung dịch TBE 10x (Tris; acid boric; EDTA): + Loading buffer 10x
+ Ethidium bromide.
* Hoá chất để tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose (QIAGEN):
+ Dung dịch QC.
+ Dụng dịch Sodium acetate. + Dung dịch Isopropanol. + Dung dịch QG.
+ Cột QIA.
* Hoá chất đểđọc trình tự gen
+ Big dye
+ Cột lọc
2.3. Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả bệnh chứng
2.3.1. Quy trình lấy mẫu
Bệnh nhân và các đối chứng được lấy 5 ml máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA với nồng độ 1,5 mg/mL.
Thân nhân của bệnh nhân (bố, mẹ, anh trai, chị gái, em gái, em trai và con bệnh nhân ) được lấy 5 mL máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA. Quy trình cần đảm bảo tuyệt đối vô trùng.
2.3.2. Quy tình tách chiết DNA từ máu ngoại vi
- Cho 0,5 mL máu tươi toàn phần đã chống đông vào ống eppendof 1,5 mL, sau đó cho thêm 0,5 mL dung dịch lyis buffer rồi để trên đá trong 10 phút.
- Ly tâm 8000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4oC, bỏ dịch nổi và thu cặn, lặp lại quá trình này 4 lần.
- Cho 0,5 mL dung dịch K vào, ly tâm 8000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4oC, bỏ dịch nổi và thu cặn.
- Cho 0,5 mL lysis buffer, 12,5 µL SDS 10%, 10 µL protease K, ủ ở 56 oC từ 2-3 giờ.
- Cho 0,5 mL phenol : chlroform : isoamyl, ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC, hồn hợp được chia làm 3 phần:
• Lớp dung dịch phía trên có chứa DNA • Lớp ở giữa là cặn tế bào
• Lớp dưới cùng là dịch chiết
Hút lấy phần dịch chứa DNA phía trên cùng và tiến hành lặp lại các bước trên một lần nữa sẽ đảm bảo không còn tạp chất trong mẫu.
- Cho 0,5 mL chloroform : isoamyl, ly tâm mẫu ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Hút lấy phần dịch trên cùng và tiến hành lặp lại một lần nữa.
- Tủa DNA bằng 1mL cồn tuyệt đối, cho thêm 50µL Na acetat, để lạnh qua đêm ở -20oC.
- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC, loại bỏ dịch nổi ở trên, thu tủa.
- Rửa tủa bằng alcol 70oC. Tủa DNA được hoà tan bằng 50 mL nước tinh khiết hoặc TE.
DNA thu được sẽ được kiểm tra độ tinh sạch bằng phuơng pháp quang phổ ở bước sóng 260/280 nm và điện di trên gel agarose 0,8%.
Kiểm tra chất lượng DNA bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu với GADPH. Cặp mồi đặc hiệu với GADPH có trình tự nucleotid như sau:
Mồi xuôi GADPH: 5’- ACA TGT TCC AAT ATG ATT CC - 3’ Mồi ngược GADPH: 5’- TGG ACT CCA CGA CGT ACT CA - 3’ - Thành phần của phản ứng khuyếch đại gen nội chuẩn GADPH: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thành phần Thể tích (µL)
10x buffer 1
2,5 mM dNTP 1 Taq polymerase 0,1 10 pmol mồi xuôi 0,5 10 pmol mồi ngược 0,5
DNA khuôn 1
Nước cất 5,9
Tổng cộng 10
- Chu trình nhiệt: 94oC/5 phút
(94oC/30 giây, 58oC/20 giây, 72oC/20 giây) × 35 chu kỳ 72oC/5 phút
Bảo quản ở 4oC.
- Điện di trên gel agarose 1,5%.
2.3.3. Kỹ thuật PCR để khuyếch đại đoạn gen đặc hiệu
Kỹ thuật PCR được ứng dụng sử dụng 6 cặp mồi khác nhau để khuyếch đại vùng tập trung đột biến của exon 15 của gen APC nhằm xác định đột biến.
Đoạn Các primer (mồi xuôi và mồi ngược) Đoạn nucleotid được khuyếch đại (codon) Kích thước (bp) 1A 5’-AGAGTGGCACCCAACCATAG-3’ 5’- TCCCATAATGCTTCCTGGTC-3’ 649-824 526 1C 5’- GCTCAAGCTTGCCATCTCTT - 3’ 5’- TATGGGCAGCAGAGCTTCTT -3’ 780-952 552 2B 5’-GTCAATACCCAGCCGACCTA-3’ 5’-AGGCTGATCCACATGACGTT-3’ 998-1176 536 2C 5’-TTCCAACCACATTTTGGACA-3’ 5’-GAGCTGATTCTGCCTCTTGG-3’ 1083-1231 536 3B 5’-CAGACGACACAGGAAGCAGA-3’ 5’-GCAGCTTGCTTAGGTCCACT-3’ 1287-1467 542 3C 5’- GTGAACCATGCAGTGGAATG-3’ 5’- TGTTGGCATGGCAGAAATAA-3’ 1420-1598 536 1A 1C 2B 2C 3B 3C
Hình : sơ đồ kỹ thuật PCR sử dụng 6 cặp mồi khác nhau để khuyếch đại exon 15 của gen APC
* Cách tiến hành:
Thực hiện 6 phản ứng PCR sử dụng từng cặp mồi 1A, 1B, 2B, 2C, 3B, 3C để khuyếch đại các đoạn gen khác nhau trên exon 15 của gen APC.
+ Thành phần của phản ứng: Thành phần Thể tích (µL) 10x buffer 0,5 10 mM dNTP 0,5 MgCl2 50mM 0,75 Taq polymerase 0,2 5 pmol mồi xuôi 1 5 pmol mồi ngược 1
DNA 1,5
Nước cất 19,55
Tổng cộng 25
+ Chu tình nhiệt của phản ứng: 94oC/5 phút
(94oC/30 giây, 58oC/20 giây, 72oC/20 giây) × 35 chu kỳ 72oC/5 phút
Bảo quản ở 4oC
Sản phẩm sau PCR 5 µL được điện di trên gel agarose 1,5 %, sau đó được nhuộm ethidium bromide và soi trên máy phát huỳnh quang để kiểm tra độ tinh sạch của DNA. Kết quả DNA của bệnh nhân được so sánh với mẫu đối chứng và marker chuẩn.
2.3.4. Phương pháp quang phổ
* Nguyên tắc đo mật độ quang:
- Acid nucleic có phổ hấp phụ cực đại ở ánh sáng tử ngoại 260 nm là do có mặt của các base purin và pyrimidin. Giá trị mật độ quang đo ở bước sóng 260 nm của các mẫu cho phép xác định nồng độ acid nucleic có trong mẫu nghiên cứu.
- Protein hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 280nm do sự hấp phụ của các acid amin thơm như Tyr, Phe và dị vòng như Trp.
- Dựa vào tỷ lệ OD260nm/OD280nm để kiểm tra độ tinh khiết của DNA. Nếu tỷ lệ OD260nm/OD280nm = 1,8 – 2 thì DNA được coi là tinh sạch.
* Tiến hành đo mật độ quang (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Pha 2µL DNA đã tách với 98 µL nước cất hai lần (pha loãng 50 lần). Đọc mật độ quang ở các bước sóng 260 nm và 280 nm, đối chiếu với ống trắng.
2.3.5. Điện di DNA sau tách chiết
Mục đích của phương pháp điện di DNA là kiểm tra định tính và định lượng các phân tử acid nucleic tách chiết được.
* Nguyên tắc: ở pH =8, acid nucleic mang điện tích âm, dưới tác dụng của dòng điện một chiều, acid nucleic sẽ di chuyển về cực dương. Các đoạn DNA có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau. Tuỳ mục đích, có thể sử dụng các chất giá khác nhau để điện di acid nucleic, phổ biến nhất là sử dụng gel agarose. Thông thường người ta sử dụng nồng độ gel là 1,5%. Bản gel điện di được nhuộm bằng ethidium bromide sẽ phát sáng trong buồng máy phát huỳnh quang.
Nếu phân tử acid nucleic tách tốt thì vạch điện di rõ nét, băng gọn. Ngược lại, phân tử DNA bị đứt gãy, nếu lẫn nhiều protein hoặc các tạp chất khác thì hình ảnh điện di là một vệt trải dài, không tạo thành băng gọn.
* Tiến hành:
- Thể tích điện di: 5µL/giếng.
- Điện di acid nucleic được thực hiện trên gel agarose ở điện thế 110V, cường độ dòng điện 0,5V và thời gian điện di là 20 phút.
2.3.6. Kỹ thật điện di trên gel agarose
* Cách tạo gel agarose 1,5%:
- Cân 1,5 g agarose, hoà tan trong 10 mL acid boric, EDTA (TBE), sử dụng lò vi sóng. Sau khi agarose tan hết, để nguội đến 55-60oC, đổ vào khuôn gel, tuỳ thuộc vào số lượng giếng cần điện di mà làm giếng với lược 4, 8 hoặc 12 răng.
- Pha dung dịch TBE 10x (Tris, acid boric, EDTA): Tris 0,89 M, acid boric 0,89 M, EDTA 2,02M.
* Tiến hành kỹ thuật điện di:
Thành phần Ống mẫu Ống thử
Dung dịch mẫu (Hae III) 5 µL
Sản phẩm DNA - 4 µL
Loading buffer 10x - 1 µL
Tổng cộng 5 µL 5 µL
- Đưa gel agarose vào máy điện di, cho TBE ngập gel.
- Dùng pipet và đầu côn nhỏ hút lần lượt dung dịch ở mỗi ống đưa vào giếng (5 µL/giếng).
- Điện di ở điện thế 110V, cường độ dòng điện 0,5V và thời gian là 20 phút.
- Cắt bản gel chứa DNA với kích thước nhỏ nhất vào ống eppendorf. - Thêm vào 400 µL dung dịch QC, lắc đều, ủ 56oC trong 10 phút để gel tan hoàn toàn.
- Thêm 10 µL dung dịch 3M sodium acetat, trộn đều. - Thêm vào 350 µL isopropanol, lắc đều, không ly tâm.
- Cho dung dịch chứa isopropanol, DNA, sodium acetat, QC vào giữa cột QIA quick colum, ly tâm 10.000 vòng/ 1 phút, đổ dịch phía dưới cột thu tủa. - Thêm 500 µL dung dịch QG vào giữa cột, ly tâm 10.000 vòng/ 1 phút, đổ dịch phía dưới cột thu tủa.
- Thêm 750 µL dung dịch PE vào giữa cột, ly tâm 10.000 vòng/ 1 phút để loại hết buffer, chuyển cột sang ống 1,5 mL.
- Thêm 20 µL nước cất vào giữa ống để 5 phút, ly tâm 10.000 vòng/ 1 phút thu DNA.
2.3.8. Giải trình tự gen
* Nguyên tắc giải trình tự gen:
Máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng ddNTP do Sanger F và cộng sự phát minh. Với các máy thế hệ sau này, người ta dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP. Nhờ vậy, phản ứng giải trình tự có thể thực hiện trong một ống nghiệm và chỉ cần điện di trên một hàng, hệ thống điện di thường là điện di mao quản. Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn ADN sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính phân tích. Dựa vào màu huỳnh quang mà máy nhận diện được là nucleotid nào, từ đó biết được trình tự của ADN đích.
2.3.8.1. Phản ứng sequencing: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thành phần Thể tích (µL)
Terminator ready 8
Mẫu PCR 2
10 pmol mồi xuôi 0,4
Nước cất 9,6 Tổng số 20 + Chu trình nhiệt: 960C/1 phút (940C/10 giây 500C/5 giây 25 chu kỳ 600C/4 phút Bảo quản ở 40C. 2.3.8.2. Tinh sạch sản phẩm: Tinh sạch sản phẩm PCR sequencing: - Thêm 45 µL SAM solution vào ống PCR
- Bổ sung 10 µL Terminator Sol, lắc đều ở 9.000 vòng/phút × 30 phút. - Ly tâm 2000 vòng/phút trong 2 phút.
2.3.8.3. Giải trình tự gen
Trình tự gen được giải theo quy trình của Matsuo và cộng sự. Trình tự chuỗi polypnucleotid của mẫu nghiên cứu được so sánh với trình tự của GenBank bằng phần mềm FASTA để xác định đột biến và so sánh với trình tự polypeptid của protein bank bằng phần mềm Translate để xác định các đột biến.
Kết quả giải trình tự cho phép xác định chính xác dạng đột biến và vị trí đột biến của gen APC ở các bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể FAP và bệnh nhân FAP. Chúng tôi đã tiến hành phân tích gen của bố, mẹ, anh, chị, em, con của bệnh nhân để phát hiện các trường hợp mang gen đột biến.
* Nguyên tắc của kỹ thuật
Trên cơ sở xác định được vị trí đột biến ở nhóm bệnh nhân ung thư ĐTT thể FAP và nhóm bệnh nhân FAP trong gia đình, chúng tôi sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để khuyếch đại đoạn gen của exon 15 bao phủ vị trí đột biến.
* Tiến hành Thành phần Thể tích (µL) 10x buffer 0,5 10 mM dNTP 0,5 MgCl2 50mM 0,75 Taq polymease 0,2
5 pmol mồi xuôi 1
5 pmol mồi ngược 1
DNA 1,5 Nước cất 19,55
Tổng số 25
+ Chu tình nhiệt của phản ứng: 940C/5 phút
→ (940C/30 giây 580C/20 giây
→ 720C/5 phút→ 40C/∞
Sản phẩm sau PCR được điện di 5 µl trên gel agarose 1,5 % ( nhuộm bởi ethidium) để kiểm tra. Kết quả của bệnh nhân được so sánh với mẫu đối chứng và marker chuẩn.
20 µl còn lại của sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% để cắt, tinh sạch và giải trình tự để xác định chính xác những vị trí đột biến.
2.3.10.2. Giải trình tự gen để xác định đột biến
So sánh trình tự chuỗi polypnucleotid của mẫu nghiên cứu với trình tự của Genbank để xác định đột biến và so sánh với trình tự polypeptid của protein bank để xác định kiểu đột biến.
2.3.10. Phân tích tiền sử gia đình của các bệnh nhân
Phân tích tiền sử gia đình nhằm tìm ra những thành viên có nguy cơ mắc bệnh cao trong các gia đình bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình vì đây là bệnh lý di truyền (cây phả hệ của các gia đình bệnh nhân nghiên cứu được trình bày trong phần kết quả).
2.4. Vấn đềđạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành dựa trên sự tự nguyện tham gia của các gia đình có bệnh nhân chẩn đoán ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình trên lâm sàng và giải phẫu bệnh. Các xét nghiệm phân tích gen chỉ thực hiện khi có sự đồng ý của bệnh nhân và người nhà bệnh nhân. Đối tượng nghiên cứu sẽ được nhận tiền bồi dưỡng cho quá trình đi lại, khám và lấy máu, hoàn toàn miễm phí các xét nghiệm phân tích gen.
Các thông tin về bệnh nhân và người nhà bệnh nhân, kết quả chẩn đoán được hoàn toàn giữ bí mật.
3. KẾT QUẢ
Để có thể xác định chính xác các đột biến dòng mầm trên gen APC ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình, các bước cơ bản trong nghiên cứu phân tích gen đã được thực hiện, bao gồm: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tách chiết và tinh sạch DNA từ máu ngoại vi: DNA từ máu ngoại vi của các bệnh nhân, thân nhân bệnh nhân cùng các đối chứng được tách chiết theo quy trình phenol/chlororfm. Sau khi tách chiết, các mẫu DNA được kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch bằng phương pháp đo mật độ quang và điẹn di trên gel agarose.
Kết quả đo quang cho thấy tất cả các mẫu DNA đều có độ tinh sạch cao với tỷ số mật độ quang ở bước sóng 260/280nm luôn nằm trong khoảng 1,8-1,9.
Sau khi tách chiết DNA theo quy trình phenol/chlororfm, tiến hành kiểm tra chất lượng DNA bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu GADPH và điện di sản phẩm trên gel agarose 1,5 %.
Các băng điện di phải là một băng sáng đồng nhất, bờ đều, sắc gọn để chứng tỏ chất lưọng sản phẩm DNA tách được có chất lượng tốt, không bị đứt gãy, tạp nhiễm nhiều protein hoặc chất khác.
Sau khi tách chiết được DNA có chất lượng tốt, chúng tôi sử dụng 6 cặp