1.5.1. Kỹ thuật hoỏ mụ miễn dịch (HMMD)
Kỹ thuật HMMD đó được ứng dụng rộng rói trờn thế giới. Đõy là bước
đột phỏ trong nghiờn cứu bệnh học phõn tử gúp phần định tớnh hoặc bỏn định lượng cỏc phõn tử khỏng nguyờn. Kỹ thuật này là phương phỏp ỏp dụng cỏc nguyờn lý và kỹ thuật miễn dịch để nghiờn cứu tế bào và mụ. Dựa trờn sự biểu lộ mang tớnh đặc hiệu khỏng nguyờn trờn bề mặt tế bào hay tại khu vực gian bào, cỏc khỏng thể đặc hiệu sẽ giỳp cho việc nhận ra và phõn loại cỏc tế bào hay mụ trờn cỏc lỏt cắt tổ chức.
- Cỏc KN cú thể hiện diện ở trong bào tương, màng hoặc nhõn tế bào. KT chủ yếu là IgG. KT kết hợp trực tiếp với KN gọi là KT thứ nhất, cú hai loại:
+ KT đa dũng: chứa nhiều KT khỏc phản ứng với nhiều quyết định KN khỏc. + KT đơn dũng: chỉ chứa một loại quyết định KN. Nhược điểm của loại KT này là cú phản ứng chộo với cỏc quyết định KN tương tự trờn một KN khụng liờn quan.
Vỡ phức hợp KN-KT khụng thể thấy được dưới KHVQH nờn cần một hệ thống để hiển thị vị trớ cú phản ứng KN-KT, gồm hai phần:
- KT thư hai: là cầu nối KT thứ nhất với hệ thống phúng đại dấu hiệu nhận biết là khỏng KT thứ nhất. KT thứ hai được gắn với Biotin trong phương phỏp ABC.
- Hệ thống phúng đại dấu hiệu nhận biết gồm một men, chất nền và chất màu. Trong phương phỏp ABC, men được gắn với KT bằng một phần cầu nối hoỏ học (Avidin và Biotin). Với một chất nền thớch hợp với men và chất màu
được gắn lờn để cho phộp xỏc định sự hiện diện của KN trong mụ dưới KHVQH. Cú nhiều phương phỏp để hiển thị phản ứng KN-KT, song phương phỏp ABC ở trờn được sử dụng nhiều vỡ cú độ nhạy và độ đặc hiệu cao, vỡ Avidin cú ỏi lực mạnh với Biotin và men Peroxidase, làm cầu nối cho men gắn vào Biotin (trờn KT thứ hai). Một phõn tử Avidin cú 4 vị trớ gắn men Peroxidase nờn hệ thống nhận biết được phúng đại lờn gấp 4 lần.
Phương phỏp sử dụng phức hợp avidin – biotin được hầu hết cỏc phũng xột nghiệm hoỏ miễn dịch sử dụng trong nghiờn cứu tế bào và mụ. Với kỹ thuật này, ỏi lực cao của avidin đối với biotin được sử dụng để gắn chất đỏnh dấu peroxidase.
Cỏc bước cơ bản của kỹ thuật miễn dịch enzym Biotin – avidin
Bộc lộ
Bộc lộ –– Kết hợp Kết hợp –– Khuyếch đạiKhuyếch đại
Kh Khááng thể ng thể IIII gắn biotin gắn biotin Kh Khááng thể ng thể II Kh
Khááng nguyng nguyênên Biotin Biotin Avidin Avidin Men Men Bệnh phẩm Bệnh phẩm đ đ ợc cố đợc cố định formolịnh formol
1.5.2. Kỹ thuật sinh học phõn tử. [ 8]
Kỹ thuật giải trỡnh tự gen trực tiếp: Đõy là phương phỏp thường được sử dụng khi mật độ tế bào ung thư trong mụ phõn tớch ≥ 30%. Với tỷ lệ này, việc cỏc định đột biến gen bằng phương phỏp giải trỡnh tự trực tiếp cú độ nhạy và độ đặc hiệu lờn đến 99%. DNA của bệnh nhõn tỏch chiết từ mẫu mụ được sử dụng để khuếch đại gen EGFR, KRAS và BRAF bằng phản ứng RCR sử dụng cỏc cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được đưa vào giải trỡnh tự trực tiếp sử dụng phương phỏp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA). Trỡnh tự gen được đối chiếu với trỡnh tự của gen EGFR, KRAS, BRAF hoang dại trờn Genbank (National center
for biotechnology information, NCBI) và phõn tớch theo phương phỏp ABI
Prism 310 genetic analyzer (Applied Biosystems).
Kỹ thuật PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism)
Phương phỏp phỏt hiện đột biến bằng kỹ thuật PCR-RFLP dựa trờn nguyờn lý: exon 21 của gen EGFR kiểu dại cú vựng trỡnh tự đặc hiệu cho enzyme Mscl, đột biến tại exon 21 gen EGFR làm mất vị trớ cắt của enzyme do đú sản phẩm PCR khụng bị cắt bởi enzyme Mscl. Tương tự, trỡnh tự kiểu dại codon 12 thuộc exon 2 của gen KRAS cú vị trớ nhận biết của enzyme giới hạn BstNI, đột biến tại codon 12 làm mất vị trớ cắt của enzyme BstNI. Với kỹ thuật này thỡ sản phẩm PCR khuếch đại cỏc exon 18-21 gen EGFR và exon 2 gen KRAS được phõn cắt bởi enzyme Mscl hoặc enzyme BstNI. Sản phẩm cắt bằng enzyme được điện di phõn tớch trờn gel agarose NuSieve GTG nồng độ 3% sẽ xỏc định được đột biến điển hỡnh trờn gen EGFR và KRAS. Đõy là phương phỏp truyền thống, đơn giản, rẻ tiền nhưng rất hiệu quả và cho độ tin cậy cao trong trường hợp xỏc định đột biến điển hỡnh. Phương phỏp này hứa hẹn khả năng ỏp dụng rộng rói trong việc sang lọc nhanh cỏc đột biến tại exon 21 của gen EGFR và đột biến tại codon 12 của gen DRAS một cỏch hiệu quả.
Kỹ thuật Scorpions-Amplification Re-farctory Mutaiton System (Scorpions ARMS).
Hiện nay, nhiều kỹ thuật sinh hoạt phõn tử được ứng dụng nhằm phỏt hiện đột biết gen EGFR, KRAS, BRAF. Tuy nhiờn chỉ một vài kỹ thuật được cỏc cơ quan quản lý Y Dược của Chõu Âu và Hoa Kỳ cấp giấy phộp cụng nhận đạt tiờu chuẩn ứng dụng trong chẩn đoỏn lõm sang. Kỹ thuật Scorpions ARMS là một trong số ớt những kỹ thuật đú (European Union in vitro
Diagnostic Medical Device Directive 98/79/EC). Scorpions ARMS là sự kết
hợp của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến (ARMS) và cụng nghệ Scorpions trong phản ứng Real time PCR để phỏt hiện cỏc đột biến. Trong đú, nguyờn lý của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến là dựa vào đặc tớnh của Taq DNA polymerase chỉ khếch đại hoàn chỉnh 1 phõn tử DNA một khi đầu 3’ của mồi và sợi khuụn bổ xung hoàn toàn với nhau. Khi đầu 3’ của mồi khụng bổ xung với sợi khuụn phản ứng PCR sẽ bị ức chế hoàn toàn. Dựa trờn nguyờn lý này, kỹ thuật cho phộp khuếch đại đặc hiệu một trỡnh tự đột biến ngay cả trong trường hợp alen đột biến đú chiếm 1 tỷ lệ rất nhỏ trong tổng số sợi khuụn DNA. Scor-pions là phõn tử cú cấu tạo một đầu mang trỡnh tự của đoạn mồi đặc hiệu với alen đột biến cần khuếch đại, đầu trỡnh tự này được nối với một đầu dũ. Fluorophore phỏt tớn hiệu huỳnh quang của đầu dũ được gắn với quencher cú nhiệm vụ dập tắt tớn hiệu huỳnh quang của fluorophore. Trong phản ứng PCR khi đầu dũ bỏm với đoạn trỡnh tự khuếch đại, Fluoro- phore được giải phúng khỏi quencher, phỏt tớn hiệu đến cảm biến của mỏy Realtime-PCR.
Kỹ thuật Smart Amplification Process (SmartAmp).
Kỹ thuật Smart Amplification Process (SmartAmp) là cụng nghệ mới nhất được phỏt triển bởi cỏc nhà khoa học tại viện cụng nghệ RIKEN – Nhật Bản nhằm phỏt hiện cỏc đột biến trờn gen EGFR và KRAS. Nguyờn lý cơ bản
của kỹ thuật SmartAmp là: Khuếch đại DNA = Phỏt hiện đột biến. Để thực hiện được nguyờn lý này kỹ thuật SmartAmp sử dụng: I) cỏc cặp mồi phỏt hiện đột biến được thiết kế bất đối xứng nhằm giảm thiểu cỏc khả năng mồi ghộp cặp sai với sợi khuụn; II) một loại protein mới với khả năng nhận biết và bỏm đặc hiệu tại vị trớ cú sự ghộp cặp khụng tương đồng giữa mồi và khuụn (TaqMutS) ngăn khụng cho phức hợp mồi khuụn được khuếch đại trong phản ứng kộo dài chuỗi. Chỉ những phức hợp mồi – khuụn DNA ghộp cặp hoàn mới được khuếch đại nhờ DNA polymerase, tớn hiệu của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu đột biến được phỏt hiện trong hệ thống mỏy Realtime-PCR. Thực tế cho thấy một trong những khú khăn của việc ỏp dụng cỏc kỹ thuật sinh học phõn tử như giải trỡnh tự, Scorpions ARMS trong thực tế lõm sang thường đũi hỏi qua nhiều bước, đội ngũ kỹ thuật viờn cú kiến thức chuyờn sõu về sinh học phõn tử, giỏ thành cao, thời gian phõn tớch kết quả lõu. Cỏc cụng trỡnh nghiờn ỏp dụng kỹ thuật SmartAmp cho thấy kỹ thuật vận hành qua 1 bước duy nhất “khuếch đại DNA = phỏt hiện đột biến”, cú độ chớnh xỏc cao, thời gian từ khõu tỏch mẫu đến cho kết quả phõn tớch đột biến gen rất ngắn: ∼ 30 phỳt. Đõy là một ưu thế nổi bật của kỹ thuật SmartAmp so với cỏc kỹ thuật khỏc như giải trỡnh tự gen (1-2 ngày), PCR-RFLP (1-2 ngày), Scorpions ARMS (3-4 tiếng). Một khi kỹ thuật SmartAmp được ỏp dụng thành cụng, kỹ thuật mới này sẽ là một cụng cụ đắc lực giỳp cỏc nhà y sinh học và cỏc bỏc sĩ lõm sang Việt Nam hiện thực húa mục tiờu y học: Điều trị bệnh theo thực trạng bộ gen của cỏ thể.