CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
2.2. Thực nghiệm
2.2.5.1. Định lượng lycopen và resveratrol bằng phương pháp sắc ký lỏng
năng cao HPLC
Định lượng lycopen
Điều kiện sắc ký:
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC-20A
- Cột sắc ký: Supelco C18 (25 cm × 4.6 mm, 5 µm).
- Detector UV-Vis: 472 nm
- Pha động: Methanol : Dichloroomethan : Acetoneitril 10:40:50 (v/v), chứa 0,05% BHT
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Dung mơi pha mẫu: DCM
- Thể tích tiêm mẫu: 10 l
- Thời gian rửa giải: 20 phút
Cách xây dựng đường chuẩn:
- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 5 mg chất chuẩn vào bình định mức tối màu 50 ml; thêm khoảng 30 ml dichloroomethan (DCM), siêu âm đến tan hoàn toàn; bổ sung DCM đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch lycopen chuẩn gốc.
- Pha loãng dung dịch chuẩn gốc để được các dung dịch chuẩn có nồng độ 0,02 mg/ml; 0,04 mg/ml; 0,06 mg/ml; 0,08 mg/ml.
- Lọc các dung dịch qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiêm mẫu.
- Phân tích các mẫu chuẩn bằng HPLC.
- Xây dựng đường chuẩn tương quan giữa nồng độ lycopen và diện tích pic.
Phương pháp định lượng lycopen trong mẫu thử
- Chuẩn bị mẫu thử: cân chính xác một lượng mẫu thử chứa 5 mg
lycopen vào BĐM 10 ml, thêm DCM, siêu âm đến tan hoàn toàn, bổ sung DCM đến
vạch; dùng pipet chính xác hút 1 ml dung dịch trên cho vào BĐM 10 ml, bổ sung DCM đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 m.
- Chuẩn bị mẫu đối chiếu: cân chính xác khoảng 5 mg lycopen chuẩn vào bình định mức 10 ml, tiến hành pha loãng tương tự mẫu thử. Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiêm mẫu.
Tiến hành phân tích lần lượt các mẫu chuẩn và mẫu thử.
Hàm lượng lycopen trong mẫu thử: được tính xác định dựa trên sự tương quan của diện tích pic lycopen của mẫu thử so với mẫu đối chiếu theo cơng thức
sau.
% Lycopen= 100
Trong đó: Cchuẩn: nồng độ dung dịch lycopen đối chiếu (mg/ml)
Mthử: khối lượng mẫu thử (mg)
Độ tinh khiết của lycopen được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Agilent series 1100, USA) tại Viện Dược liệu Trung
ương.
Định lượng resveratrol
Các bước tiến hành định lượng resveratrol tương tự như các bước tiến hành định lượng lycopen. Tuy nhiên, chỉ khác về điều kiện sắc ký, cụ thể là đối với
resveratrol các điều kiện như sau:
- Cột sắc ký: XDB- C18 (4.6 x 150 mm, 5 μm) (CUD-1)
- Detector UV-Vis: 310 nm
- Pha động: MeOH- H2O+0,1%Fa = 40 – 60 (v/v)
- Tốc độ dòng: 0.5 ml/phút
- Hệ áp suất: 131 bar
- Thể tích tiêm mẫu: 5 l
- Thời gian rửa giải: 15 phút
Độ tinh khiết của resveratrol được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Agilent series 1200, USA) tại Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.5.2. Định lượng các hợp chấtbằng quang phổ hấp thụ UV-Vis
Cân chính xác 20 mg lycopen hoặc resveratrol tinh khiết vào bình nón chứa
20 g dung môi, siêu âm đến khi các hợp chất tan hết. Sử dụng pipet hút và cân chính xác 100 mg dung dịch trên vào bình nón 100 ml chứa 50 g dung môi, thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 2 ppm.
Dùng diclometan làm mẫu trắng đối với quá trình định lượng lycopen, đối
pha bằng máy đo quang phổ hấp thụ UV-Vis SP-3000 nano trong dải bước sóng từ
200-800nm (đối với lycopen) và từ 200-500nm đối với hợpchất resveratrol.
Hàm lượng lycopen cịn lại được tính tốn dựa trên cơng thức sau: Hàm lượng lycopen còn lại (%) = x 100 (1)
Trong đó: I0: Cường độ hấp thụ ở 478 nm tại thời điểm ban đầu
It: Cường độ hấp thụ ở 478 nm sau thời gian t.
Hàm lượng resveratrol cịn lại được tính tốn dựa trên cơng thức tương tự như công thức (1), tuy nhiên cường độ hấp thụ của resveratrol là ở 310 nm.
Phổ hấp thụ UV-Vis được tiến hành trên máy quang phổ SP-3000 nano tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.6. Đánh giá độ bền của các hạt nano
2.2.6.1. Khảo sát sự biến đổi hàm lượng hợp chấtcủa các hạt nano
* Nano lycopen
Sự phân hủy của lycopen trong các mẫu bột nano lycopen theo thời gian khi lưu trữ ở nhiệt độ phòng được xác định bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis (SP-3000
nano).
Hàm lượng lycopen còn lại trong các mẫu nano lycopen được tính tốn dựa trên công thức tương tự như công thức (1) trong mục 2.2.5.2.
* Nano resveratrol
Độ ổn định của resveratrol trong các mơi trường có độ pH khác nhau được thực hiện như sau:
20 mg bột nano resveratrol (chứa 10% resveratrol) được hịa tan hồn tồn trong 200 ml nước cất, thu được dung dịch có nồng độ 100 ppm. Dung dịch sau đó được chia đều lần lượt vào 4 bình nón A, B, C và D. Tiếp theo, dung dịch NaOH 0,01N được nhỏ từ từ vào các bình nón A, B và C; kết hợp chạy máy đo pH MP220 (Mettler Toledo, Thụy Sỹ), thu được ba dung dịch có độ pH lần lượt là 7, 8 và 9. Tương tự, để thu được dung dịch có mơi trường acid bằng 4,5; dung dịch HCl 0,1N được nhỏ từ từ vào bình nón D đến khi máy đo pH ổn định ở pH bằng 4,5.
Sự phân hủy của resveratrol trong các dung dịch A, B, C và D theo thời gian
được xác định bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis (SP-3000 nano). Hàm lượng
trong mục 2.2.5.2.
* Hệ nano lycopen/resveratrol
Vitamin E và BHT với hàm lượng 4% được sử dụng làm chất chống oxy hóa
để ổn định nano lycopen/resveratrol (Bảng 2.4).
Sự phân hủy của lycopen trong hệ nano lycopen/resveratrol ở điều kiện bảo
quản nhiệt độ phòng và ở -16oC theo thời gian được xác định bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis (SP-3000 nano). Hàm lượng lycopen còn lại trong các mẫu hệ nano
lycopen/resveratrol được tính tốn dựa trên cơng thức tương tự như cơng thức (1)
trong mục 2.2.5.2.
2.2.6.2. Nghiên cứu sự biến đổi hình tháicủa các hạt nano
* Nano resveratrol
Hình thái hạt của nano resveratrol trong mơi trường pH=4,5 được phân tích bằng ảnh TEM và giản đồ phân bố kích thước hạt tương tự như đối với hệ nano
lycopen/pycnogenol.
* Hệ nano lycopen/pycnogenol
Hình thái hạt của nano lycopen/pycnogenol trong các môi trường pH khác
nhau được thực hiện như sau:
30 mg mẫu bột S1 được hịa tan hồn tồn trong 60 ml nước cất, thu được dung dịch có nồng độ 500 ppm. Dung dịch sau đó được chia đều lần lượt vào 2 bình nón S1a và S1b. Tiếp đó, dung dịch NaHCO3 0,01N được nhỏ từ từ vào bình nón S1a;
kết hợp chạy máy đo pH MP220 (Mettler Toledo, Thụy Sỹ), thu được dung dịch có pH bằng 9. Tương tự, để thu được dung dịch có mơi trường pH bằng 5; dung dịch CH3COOH 0,1N được nhỏ từ từ vào bình nón S1b đến khi máy đo pH ổn định ở pH
bằng 5.
Quá trình thực nghiệm pha các mẫu bột S2 và S3 trong môi trường pH 5 và 9 tiến hành tương tự các bước như mẫu S1.
Nano lycopen/pycnogenol trong các dung dịch sau đó được phân tích hình thái hạt bằng ảnh TEM và giản đồ phân bố kích thước hạt.
2.2.7. Các phương pháp phân tích cấu trúc và tính chất của vật liệu
a) Xác định cấu trúc của các vật liệubằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Mẫu nghiên cứu được đo bằng phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân trên máy Bruker Avance 500 MHz sử dụng dung mơi CDCl3 và DMSO-d6 tại Viện Hóa học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
b) Xác định khối lượng phân tử của copolymer PLA-PEG
Khối lượng phân tử của copolymer được đo bằng máy sắc ký thấm gel (GPC)
ở 400C sử dụng hệ thống GPC TOSOH HLC-8220 với cột HM-H và dung môi chlorooform (0,6 ml*min-1) tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
c) Nghiên cứu cấu trúc của các mẫu vật liệubằng phổ hồng ngoại (FT-IR)
Các mẫu vật liệu cần phân tích lấy khoảng 1-2 mg sau đó nghiền mịn và trộn
đều với KBr, ép thành viên mỏng rồi đo phổ FT-IR. Phổ FT-IR được đo trên máy
GX-Perkin Elmer (Mỹ) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
d) Nghiên cứu sự phân bố kích thước hạt của các sản phẩm bột nano bằng phương
pháp tán xạ ánh sáng động DLS
Các mẫu sản phẩm bột nano được nghiên cứu và xác định kích thước hạt trung bình bằng thiết bị tán xạ ánh sáng động DLS Litesizer™ 500 tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
e) Đánh giá hình thái và kích thước các mẫu vật liệu nano bằng kính hiển vi điện tử
truyền qua TEM
Hình thái của các hạt nano được xác định bằng kính hiển vi điện tử truyền
qua JEM 1400 tại phịng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Vật liệu Polymer và Compozit –Trường Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả chiết tách lycopen, resveratrol và tổng hợp copolymer PLA-PEG, sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho quá trình chế tạo các hệ nano sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho quá trình chế tạo các hệ nano
3.1.1. Chiết tách lycopen từ màng quả gấc
3.1.1.1. Xác định nhiệt độ và thời gian thích hợp cho q trình sấy màng gấc
Màng gấc tươi được tiến hành khảo sát sấy ở các nhiệt độ khác nhau. Trong quá trình sấy, xác định độ ẩm của mẫu gấc và dừng việc sấy khi độ ẩm của màng gấc không đổi, hoặc thay đổi rất chậm. Kết quả được thể hiện trong Hình 3.1.
K hố il ư ợ ng m à n g gấ c (% ) Thời gian (h) K hố ilư ợ ng m à n g gấ c (% ) Thờigian (h)
Hình 3.1. Sự suy giảm khối lượng của màng gấc khi sấy ở các nhiệt độ khác nhau
Hình 3.1 cho thấy, xu hướng chung về động thái giảm ẩm của các mẫu sấy là độ ẩm giảm nhanh ở 5 - 10 giờ sấy đầu tiên. Tốc độ giảm ẩm chậm dần và gần như không giảm ở những giờ cuối cùng. Ở nhiệt độ sấy 60oC, 70oC, 80oC và 90oC, độ ẩm giảm đều trong 10 giờ đầu và chậm dần trong các giờ tiếp sau. Sau 15 giờ sấy ở
60oC và 70oC, khối lượng màng hạt gấc còn lại là 31,5% và 32,0%. Tiếp tục sấy đến 20 giờ tuy nhiên độ ẩm giảm rất ít và khơng đổi ở những giờ tiếp theo. Nhận thấy, thời gian tiếp xúc với nhiệt và oxy trong khơng khí càng lâu thì màu sắc của màng hạt gấc càng đậm và gấc mất đi mùi đặc trưng. Do đó, ở nhiệt độ 60oC và 70oC, thời gian sấy 15 giờ là đủ để làm khô màng hạt gấc. Khi sấy mẫu gấc ở nhiệt độ 80oC và 90oC, độ ẩm giảm nhanh trong 5 giờ đầu tiên, sau 15 giờ, khối lượng màng hạt gấc
cịn tới 32,5% và 32,7%. Có thể thấy rằng nhiệt độ sấy càng cao thì khả năng loại ẩm càng giảm. Đó là do nhiệt độ cao làm hơi nước bay hơi rất nhanh trên bề mặt, các mao mạch và tế bào ở phía ngồi co lại và ngăn cản việc chuyển ẩm từ trong ra ngoài bề mặt dẫn đến độ ẩm cuối cùng cao. Ngoài ra, khi sấy ở nhiệt độ càng cao, thì phản ứng phân hủy carotenoid càng mạnh, sấy ở nhiệt độ từ 80ºC trở lên thì màu sắc và mùi của màng hạt gấc đều khơng cịn giữ được nét đặc trưng. Màng hạt gấc có màu sẫm hơn và có thoảng mùi khét, màu và mùi này tăng lên cùng với sự tăng nhiệt độ. Màng hạt gấc sấy ở nhiệt độ cao hơn ngồi việc có nguy cơ bị phân hủy và mất màu, cịn có khả năng bảo quản kém hơn do có độ ẩm lớn. Như vậy, nhiệt độ và thời gian thích hợp cho việc sấy màng hạt gấc là 60oC trong vòng 15 giờ.
Độ ẩm cuối cùng của các mẫu màng gấc ở các nhiệt độ khác nhau được đo nhanh bằng máy Kern MRS 120-3, kết quả thể hiện trong Hình 3.2.
Đ ộ ẩm m àn g gấ c (%) Nhiệt độ (oC)
Hình 3.2. Đồ thị độ ẩm cuối cùng của màng gấc sấy ở các nhiệt độ khác nhau
Độ ẩm cuối cùng của màng gấc sấy ở nhiệt độ 60oC, 70oC, 80oC và 90oC lần lượt là 6,98%; 8,41%; 9,82% và 10,37 %. Nhận thấy, ở 60oC độ ẩm đạt 6,98%, kết quả này so với kết quả của Trans (2008) [114] là 6,02%, so với kết quả nghiên cứu
của Vũ Thị Hằng (2013) [115] là 7,35%. Kết luận nghiên cứu của Trans nhận định:
độ ẩm bền để bảo quản màng gấc là 6,02% là độ ẩm tối ưu nhất. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này độ ẩm của màng gấc sau khi sấy ở nhiệt độ 60oC là 6,98% có sự
chênh lệch nhưng khơng đáng kể.
Ngồi ra, khi đánh giá cảm quan chất lượng màng gấc sau khi sấy, kết quả sấy cho thấy sự khác nhau rõ rệt về màu sắc và mùi của các mẫu màng gấc khi được sấy ở các nhiệt độ khác nhau. Màu sắc và mùi vị của màng gấc sau khi sấy được trình bày cụ thể ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Màu sắc và mùi vị màng gấc khi sấy ở các nhiệt độ khác nhau sau 15 giờ
Nhiệt độ Màu sắc Mùi vị
60oC Màu đỏ tươi Mùi thơm đặc trưng
70oC Màu đỏ tươi Mùi thơm đặc trưng
80oC Màu đỏ sẫm Thoảng mùi khét
90oC Màu đỏ rất tối màu Mùi khét rõ rệt
Nhận thấy, hàm lượng carotenoid có trong gấc tương đối cao do vậy màng hạt gấc ln có màu đỏ đậm. Khi sấy ở 600C, lượng nước tự do và nước liên kết trong màng đỏ hạt bốc hơi từ từ nên không làm tổn thất nhiều lượng carotenoid, do đó màng hạt gấc có mùi thơm đặc trưng và màu đỏ ngả sang cam. Khi sấy ở 700C, ở nhiệt độ này đã xảy ra một số phản ứng dẫn tới sự hình thành một số chất có màu
đậm, điều này làm cho màng hạt gấc mặc dù vẫn giữ được mùi thơm đặc trưng nhưng màu sắc có phần tối hơn so với bột sấy ở 600C. Nhiệt độ càng cao, thì phản
ứng tạo màu, tạo mùi và phản ứng phân hủy carotenoid càng mạnh, sấy ở 800C và 90oC thì màu sắc và mùi của màng hạt gấc đều khơng cịn giữ nét đặc trưng. Màng hạt gấc có màu đỏ sẫm và thoảng mùi khét. Màu sắc của màng hạt gấc có mối liên quan với hàm lượng carotenoid trong gấc, màu sắc màng hạt gấc tỷ lệ thuận với
hàm lượng carotenoid. Sự suy giảm màu sắc do sự thay đổi các đồng phân hình học
của β-carotene. Các phản ứng hóa nâu phi enzyme như phản ứng Maillard cũng có
thể gây ra sự suy giảm màu sắc.
Như vậy, kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến chất lượng màng hạt gấc cho thấy, màng hạt gấc sấy ở nhiệt độ 60oC trong 15 giờ có độ ẩm thấp nhất và đây cũng là độ ẩm đảm bảo duy trì độ bền màu tốt nhất cho màng gấc.
Hình 3.3. Hình ảnh màng hạt gấc khô sấy ở 60oC trong 15 giờ
3.1.1.2. Xác định dung môi hữu cơ phù hợp để chiết lycopen từ màng gấc khôbằng
phương pháp Soxhlet
Độ hòa tan của lycopen trong các dung môi diclometan, tetrahydrofuran, cloroform và n-hexan ở nhiệt độ phòng đã được khảo sát. Kết quả thu được như trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Độ hịa tan của lycopen trong một số dung mơi hữu cơ ở nhiệt độ phịng
Hợp chất Dung mơi hữu cơ Độ hòa tan (mg/g)
Lycopen Cloroform 12,2
Lycopen Tetrahydrofuran 6,9
Lycopen Diclometan 6,7
Lycopen n-hexan 0,5
Hợp chất tan tốt nhất trong dung môi cloroform, sau đó giảm dần từ tetrahydrofuran, diclometan đến n-hexane. Tuy nhiên, do độc tính thấp nhất,
diclometan được lựa chọn là dung mơi thích hợp để chiết lycopen. Ngồi ra, việc sử dụng diclometan cịn có ưu điểm là nhiệt độ sơi thấp, tốc độ bay hơi nhanh giúp cho việc chiết tách bằng phương pháp Soxhlet có thể thực hiện được ở nhiệt độ thấp, không làm phân hủy lycopen. Hơn nữa, nhiệt độ bay hơi thấp cũng giúp cho việc