Sử dụng các phần mềm Microsoft word, Microsoft excel để viết báo cáo cũng như tính toán và xử lý số liệu.
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ với vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Tổng cộng có 8 chủng A. hydrophila (CA1.2T, CA1.3TT, CS2.3T, TN1.1T, TN2.4TT, SĐ2.1T, CAF2, TN2.1G) được phục hồi và nuôi cấy trên môi trường thạch NA (Hình 4.1). Sau đó xác định tính thuần của vi khuẩn thông qua kết quả nhuộm Gram (Hình 4.2).
Sau khi vi khuẩn đã được kiểm tra tính thuần, thì được nuôi trong môi trường NB trong 24 giờ và tiến hành kiểm tra kháng sinh đồ với 8 loại kháng sinh gồm: Amoxicillin (AMX, 25µg), ciprofloxacin (CIP, 5µg), colistin (CS, 50µg), florfenicol (FFC, 30µg), doxycycline (DO, 30µg), oxolinic acid (OA, 2µg), streptomycin (S, 10µg), norfloxacin (NOR, 10µg) (Bảng 4.1).
Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ
Kháng sinh
Đường kính trung bình vòng vô trùng (mm)
CAF2 TN1.1 T CA1.3 TT TN2.4T T CA1.2 T CS2.3 T TN2.1 G SĐ2.1 T Amoxycillin (AMX, 25µg) R 0 9 9 9 8 9 10 I S 18 Ciprofloxacin (CIP, 5µg) R 0 I S 21 23 23 29 22 25 25 Colistin (CS, 50µg) R I 10 10 S 12 11 11 12 11 12 Doxycycline (DO, 30µg) R 9 I S 26 30 26 30 25 26 32 Florfenicol (FFC, 30µg) R 10 I S 30 34 30 31 20 31 35 Oxolinic acid (OA, 2µg) R 0 0 0 I S 19 18 19 20 19 Streptomycin (S, 10µg) R 0 I S 17 20 18 18 16 17 21 Norfloxacin (NOR, 10µg) R 0 I 15 S 20 23 21 25 22 23 Ghi chú: R−Kháng, I−Trung bình, S−Nhạy S FFC AMX CIP
Từ kết quả trên cho thấy, kháng sinh amoxycillin kháng với hầu hết các chủng nghiên cứu, chỉ duy nhất 1 chủng (CS2.3T) khảo sát mẫn cảm với kháng sinh này (với đường kính vòng vô trùng là 18mm). Điều này cho thấy Aeromonas hydrophila gần như kháng hoàn toàn với amoxicillin. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của Nguyễn Thị Thúy Hằng (2008) với vi khuẩn A. hydrophila đã cho kết quả kháng với amoxicillin. Bên cạnh đó, theo Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc (2006) thì Aeromonas cũng đã kháng với amoxicillin. Theo kết quả khảo sát của Phan trọng Duy (2007) và Châu Hồng Thúy (2008) thì kháng sinh amoxycillin được người nuôi sử dụng rộng rãi (có trên 70% số hộ khảo sát). Đây có thể là nguyên nhân gây nên hiện tượng kháng amoxicillin ở vi khuẩn này.
Đối với các kháng sinh ciprofloxacin, doxycycline, florfenicol, streptomycin, colistin và norfloxacin, đều cho kết quả nhạy với hầu hết các chủng nghiên cứu. Trong đó, có 1/8 chủng nhạy trung bình với norfloxacin và 2/8 chủng với colistin. Tuy nhiên, các kháng sinh này (ngoại trừ colistin) thì gần như bị kháng hoàn toàn bởi chủng CAF2. Điều này cũng đã được Nguyễn Thị Thúy Hằng (2008) kết luận chủng CAF2 đã kháng với doxycycline.
Như vậy, các kháng sinh ciprofloxacin, doxycycline, florfenicol, streptomycin, colistin và norfloxacin vẫn có thể sử dụng để trị bệnh trên cá do vi khuẩn A. hydrophila. Cụ thể, theo hướng dẫn của Từ Thanh Dung và ctv (2005), Bùi Quang Tề (2008) thì doxycycline và streptomycin có thể dùng để trị bệnh do A. hydrophila gây ra. Gần đây, từ kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của Nguyễn Thị Thúy Hằng (2008) và Nguyễn Minh Nhí (2007) trên vi khuẩn A. hydrophila cũng cho kết quả mẫn cảm với các kháng sinh norfloxacin, oxolinic acid, amoxicillin, colistin, streptomycin, và doxycycline. Bên cạnh đó, theo kết quả nghiên cứu của Saitanu et al., (1994) trên 68 chủng A. hydrophila phân lập trên cá nuôi ở Thái Lan cũng cho kết quả hầu hết nhạy với các kháng sinh norfloxacin, ciprofloxacin, streptomycin.
Riêng kháng sinh oxolinic acid lại cho thấy việc sử dụng chúng để trị bệnh do A. hydrophila là cần phải cân nhắc. Bởi từ kết quả thu được có 3/8 chủng sử dụng cho kết quả kháng hoàn toàn, 5/8 chủng nhạy ở mức khá cao (dao dộng từ 18- 20mm) và nhiều kết quả nghiên cứu khác như: Jitkasem (1994) A. hydrophila
kháng với oxolinic acid, Cao Tuấn Anh và ctv (2006) thì vi khuẩn này lại bị khống chế bởi oxolinic acid (Nguyễn Thị Thúy Hằng (2008).
Bên cạnh đó, thì kết quả kháng sinh đồ còn cho thấy xuất hiện hiện tượng đa kháng thuốc ở vi khuẩn (một chủng vi khuẩn kháng đồng thời từ 2 loại kháng sinh trở lên). Biểu hiện ở các chủng: CA1.3TT và SĐ2.1T kháng với AMX+OA, CAF2 kháng với 7/8 loại kháng sinh (AMX, OA, S, CIP, NOR, FFC, DO) thử nghiệm. Hiện tượng đa kháng thuốc trên vi khuẩn phân lập từ các hệ thống nuôi thủy sản ở ĐBSCL cũng được Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2005) đề cập với khoảng 59% dòng vi khuẩn (trong 196 dòng) nghiên cứu kháng với 4 hay loại kháng sinh thử nghiệm.
Từ đó, ta có thể thấy việc kháng thuốc của vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản là một vấn đề cần phải quan tâm. Bởi cùng một loại kháng sinh nhưng lại cho kết quả kháng sinh đồ khác nhau rất nhiều trong cùng một loài cũng như trong các nghiên cứu với nhau. Sự khác biệt trên có thể do phương thức và mức độ sử dụng thuốc trong quá trình nuôi của người dân giữa các vùng là khác nhau. Chẳng hạn, ở một ao nuôi nào đó thường xuyên sử dụng nhóm quinolones để trị bệnh do A. hydrophila thì nguy cơ vi khuẩn này kháng với các kháng sinh thuộc nhóm quinolones là rất cao. Nhưng với ao nuôi khác không sử dụng kháng sinh nhóm quinolones thì khả năng kháng các kháng sinh thuộc nhóm này là rất thấp. Trong nghiên cứu của Saitanu et al (1994) trên A. hydrophila, cũng đã cho thấy trong 19 kháng sinh sử dụng có 2 kháng sinh: sulfamonomethoxine (SA) và tetracycline (TC) kháng hoàn toàn với 68 chủng nghiên cứu, thì 2 kháng sinh này được sử dụng thường xuyên trong quá trình nuôi.
Mặc khác, việc kháng thuốc của vi khuẩn còn có thể do người nuôi sử dụng thuốc bừa bãi, không đúng quy tắc sử dụng thuốc an toàn và chưa nắm vững những tác hại của việc phối hợp thuốc không đúng cách trong điều trị. Hàng loạt các kết quả khảo sát của Nguyễn Thị Phương Nga (2004), Phạm Thanh Tuấn (2004), Nguyễn Chính (2005), Phan Trọng Duy (2007), và Nguyễn Tấn Duy Phong (2008) cũng cho thấy đa phần các hộ được điều tra cho biết việc sử dụng thuốc để trị bệnh cá, tôm là do kinh nghiệm cá nhân. Còn về nguồn gốc của thuốc thì không rõ ràng, không nhãn mác của nhà sản xuất và liều lượng sử dụng cũng là do kinh nghiệm, mà một số kháng sinh họ dùng là kháng sinh nguyên liệu hoặc dựa vào sự mô tả của người nuôi thì các cửa hàng kinh doanh thuốc cũng kê đơn. Thêm nữa, thời gian điều trị không đúng, cũng như thời gian ngưng thuốc cũng không đúng và đặc biệt việc sai quy tắc về phối hợp kháng sinh cũng không nằm ngoài những nguyên nhân gây nên vi khuẩn kháng thuốc, ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng sức khỏe cộng đồng mà đa phần các hộ nuôi trồng thủy sản ở ĐBSCL đang mắc phải.
Không riêng về kháng sinh vi khuẩn đã kháng mà tất cả các kháng sinh, khi dùng để trị bệnh cho động vật thủy sản đều cần đến hướng dẫn của cán bộ chuyên môn. Một mặt để tránh việc điều trị gặp nhiều khó khăn do vi khuẩn kháng thuốc, mặt khác nhằm bảo vệ môi trường và sức khỏe cộng đồng. Bởi theo Wegener et al., (1999) và Inglis (2000) thì các chất diệt khuẩn trong đó có kháng sinh có thể đưa vào môi trường nước qua thức ăn, từ thức ăn thừa có trộn thuốc hoặc từ sản phẩm bài tiết của vật nuôi. Những yếu tố đặc biệt nguy hiểm cho sự hình thành tính kháng thuốc là việc sử dụng thuốc ở mức độ thấp hơn liều dùng để chữa trị và sự kết hợp một cách bất hợp lý các loại thuốc kháng sinh (Wegener et al., 1999; Inglis, 2000; Threlfall et al., 2000. Trích dẫn bởi Đặng Thị Hoàng và ctv 2005) Cụ thể, theo kết quả nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng và ctv (2005) cho thấy phần lớn các dòng (196 dòng) vi khuẩn thí nghiệm có thể kháng với nhiều loại kháng sinh, trong đó có 59% dòng vi khuẩn kháng với 4 hay 5 loại kháng sinh. Đại diện cho nghiên cứu này là chủng CAF2 có 7/8 kháng sinh sử dụng bị kháng.
Từ những lý do trên, ta có thể hiểu rõ hơn việc khác biệt trong những nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn. Để có kết quả tốt trong điều trị, phải cần đến sự hướng dẫn của cán bộ thú y, càng tốt nếu trước khi sử dụng kháng sinh để trị bệnh cá ta tiến hành lập kháng sinh đồ với phương pháp chuẩn, nhằm biết rõ loại kháng sinh có thể sử dụng cho ao cá tôm của mình, sẽ mang lại hiệu quả cao hơn khi tự ý sử dụng và tránh được những điều đáng tiết có thể xảy ra. Theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2005), Từ Thanh Dung và ctv (2005) và Từ Thanh Dung (2008), cũng khuyến cáo nên sử dụng thuốc đúng thời điểm, đúng bệnh và đúng cách, thêm nữa là khi cá vừa mới chớm bệnh (phát hiện bệnh sớm) thì kết quả điều trị sẽ rất tốt. Và với thời điểm hiện nay thì việc lập kháng sinh đồ khi sử dụng thuốc kháng sinh trị bệnh cá, tôm là rất cần thiết.
4.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Qua kết quả kháng sinh đồ chọn ra các loại kháng sinh mà vi khuẩn mẫn cảm để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh với vi khuẩn A. hydrophila. Do giới hạn của đề tài nên chỉ xác định giá trị MIC của streptomycin với vi khuẩn A. hydrophila.
Kết quả xác định giá trị MIC của streptomycin với 8 chủng vi khuẩn A. hydrophila cho thấy có 7/8 chủng bị bức chế bởi streptomycin, có giá trị MIC dao động từ 4−16ppm và chỉ có 1/8 chủng cho kết quả kháng với giá trị MIC ở 256ppm (Hình 4.4).
Hình 4.4: Kết quả MIC của streptomycin với vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Như vậy, trong 8 chủng nghiên cứu thì có 7 chủng cho kết quả nhạy và chỉ duy nhất một chủng (CAF2) kháng với streptomycin ở mức 256ppm. Kết quả MIC của chủng CAF2 hoàn toàn phù hợp với kết quả kiểm tra kháng sinh đồ trong đề tài và kết quả nghiên cứu kháng sinh đồ của Huỳnh Thị Phượng Quyên (2008) cũng cho thấy CAF2 kháng với streptomycin.
Tuy nhiên, nhìn chung trong số vi khuẩn cho kết quả nhạy thì có 3/8 chủng có giá trị MIC khá cao (16ppm). Điều này có thể thấy ở kết quả kháng sinh đồ, thì kháng sinh streptomycin cho kết quả nhạy nhưng không cao (Bảng 4.1). Bên cạnh đó, theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Minh Nhí (2007) trên vi khuẩn A. hydrophila cũng đã cho kết quả nhạy trung bình với streptomycin. Ngoài ra, theo Crumlish et al., (2006) vi khuẩn A. hydrophila phân lập trên cá tra nuôi ở ĐBSCL cũng mẫn cảm với streptomycin.
Cũng từ kết quả nghiên cứu của Saitanu et al (1994), trong 68 chủng Aeromonas hydrophila phân lập trên cá nuôi từ Thái Lan thì tất cả được xác định là kháng với ampicillin. Có 14 chủng nhạy cảm với 18/19 loại kháng sinh sử dụng gồm: Cefazolin, chloramphenicol, kanamycin, furazolidone, sulfamonomethoxine, streptomycin, tetracycline, trimethoprim, Flumequine, miloxacin, nalidixic acid,
37.5% 0 4 8 8 8 16 16 16 256 0 50 100 150 200 250 300
CS2.3T CA1.2T TN2.4TT CA1.3TT TN1.1T SĐ2.1T SĐ2.1T CAF2
Chủng vi khuẩn G iá t r ị M IC ( p p m )
oxolinic acid, piromidic acid, pipemidic acid, ciprofloxacin, enoxacin, norfloxacin and ofloxacin ngoại trừ ampicillin. Trong khi 54 chủng còn lại kháng với Cefazolin, chloramphenicol, streptomycin, tetracycline, sulfamonomethoxine, trimethoprim. Kết quả kiểm tra MIC trên 30 chủng A. hydrophila phân lập trên cá với streptomycin cho thấy có khoảng 25/30 chủng có giá trị MIC dao động từ 6- 25ppm (µg/ml) và 5 chủng có MIC dao động 50-100ppm. Ngoài ra, ông còn cho biết việc kháng một loại thuốc nào đó của vi khuẩn có thể là do việc sử dụng kháng sinh này thường xuyên trong quá trình nuôi trị bệnh do vi khuẩn gây ra. Từ đó, cho thấy kháng sinh streptomycin vẫn còn khả năng khống chế vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá. Mặc khác, chúng ta có thể nhận định rằng việc kháng một loại kháng sinh, hay giá trị MIC xác định của một loại kháng sinh nào đó có liên quan đến mức độ và việc thường xuyên sử dụng kháng sinh đó để trị bệnh cho đối tượng nuôi.
Hình 4.5: Kết quả MIC ở nồng độ 256ppm (mũi tên)
Ống 1: Đối chứng âm (−); ống 2: 2ppm; ống 3: 4ppm; ống 4: 8ppm; ống 5: 16ppm; ống 6: 32ppm; ống 7: 64ppm; ống 8: 128ppm; ống 9: 256ppm; ống 10:
512ppm; ống 11: Đối chứng dương (+)
4.3 Kết quả ly trích plasmid của vi khuẩn A. hydrophila
Tương tự việc kiểm tra kháng sinh đồ và MIC, với quá trình ly trích plasmid vi khuẩn cũng được kiểm tra tính thuần và được nuôi trong ống nghiệm 10ml NB. Sau đó tiến hành ly trích plasmid và điện di xác định kiểu plasmid của vi khuẩn
A. hydrophila (Hình 4.6).
1 2 3 4 5 6 7 8
2
Hình 4.6: Kết quả điện di trên 8 chủng Aeromonas hydrophila
Giếng M: CAF9; Giếng 1: CAF2; giếng 2: TN1.1T; giếng 3: CA1.3TT; giếng 4: TN2.4TT; giếng 5: CA1.2T; giếng 6: CS2.3T; giếng 7: TN2.1G; giếng 8: SĐ2.1T Kết quả điện di trên cho thấy chỉ có sự hiện diện vạch plasmid của 2 chủng CA1.2T và CA1.3TT. Các chủng còn lại thì không xác định được vạch plasmid của chúng. Trong 2 chủng xác định plasmid thì chúng có kiểu plasmid khác nhau, thể hiện hai vạch plasmid không tương đương nhau. Trong đó vạch ở giếng số 3 (chủng CA1.3TT) không biểu hiện rõ như vạch ở giếng số 5 (chủng CA1.2T). Bên cạnh đó, trong kết quả kháng sinh đồ chủng CA1.3TT thể hiện tượng đa kháng thuốc (kháng với AMX và OA), trong khi chủng CA1.2T chỉ kháng 1 trong 8 loại kháng sinh đã thử nghiệm. Như thế, có thể giả thiết rằng việc biểu hiện vạch plasmid của chủng CA1.2T khi điện di là do vi khuẩn này có plasmid kháng thuốc bởi sự tác động của các loại kháng sinh khác (ngoài các loại kháng sinh đề tài đã sử dụng). Hoặc, cũng có thể do plasmid của chủng CAF2 có được không mang gen kháng thuốc.
Mặc khác, trong khi các chủng còn lại cũng kháng với một loại kháng sinh (amoxicillin) nhưng không thể hiện vạch plasmid và chủng CAF2 đã kháng với 7/8 loại kháng sinh sử dụng cũng không cho kết quả vạch plasmid khi điện di.
Điều này có thể do những chủng chỉ kháng 1 loại kháng sinh là bởi chúng không hình thành plasmid kháng thuốc (R-plasmid), mà việc kháng thuốc này được hình thành trong quá trình sử dụng thuốc của người nuôi. Riêng việc không cho kết quả vạch plasmid của chủng CAF2 trong khi chủng này thể hiện hiện tượng đa kháng thuốc, có thể do nhiễm sắc thể của vi khuẩn này đọc mã cho khả năng kháng thuốc trên.
Theo Nguyễn Lân Dũng và ctv (2007), việc kháng thuốc ở vi khuẩn ngoài do plasmid của vi khuẩn đọc mã thì việc kháng thuốc còn do nhiễm sắc thể đọc mã, dựa vào sự thay đổi hạt riboxom 30S của chúng. Trái lại, tính kháng kháng sinh do plasmid lại dựa vào sự biến đổi chất kháng sinh này nhờ vào tác dụng của một enzim. Điển hình với kháng sinh streptomycin thì kháng sinh này sẽ bị adenyl hóa bởi enzim khi sự kháng thuốc ở vi khuẩn được plasmid đọc mã. Mặc khác, theo Nguyễn Hoàng Lộc và ctv (2007) việc hiện diện có hoặc không có vạch plasmid có thể do vi khuẩn có hay không có plasmid và có thể plasmid nằm trong nhiễm sắc thể của vi khuẩn ở dạng tái tổ hợp với nhiễm sắc thể vi khuẩn.
Bên cạnh đó, theo Majumdar et al., (2007), việc tồn tại của R-plasmid trong A. hydrophila sẽ ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc bề mặt, sự phát triển và tính độc của chúng khi được cảm nhiễm vào vật chủ. Và R-plasmid này quyết định đến sự phát sinh dịch bệnh do A. hydrophila. Ngoài ra, sự hiện diện R-plasmid hay không của
A. hydrophila còn quyết định tính kháng hay mẫn cảm với một loại kháng sinh mà nó đã kháng trước đó. Cụ thể, trong nghiên cứu của ông trên vi khuẩn A. hydrophila (được ký hiệu là Wt-VB21) mang plasmid với trọng lượng khoảng 21kb (kilobazơ) thì chủng này đa kháng với hầu hết kháng sinh: gatifloxacin (5µg), ampicillin (10µg), erythromycin (15µg), cefuroxime (30µg), chloramphenicol (30µg) và tetracycline (30µg).
Từ kết quả nghiên cứu của Saitanu et al., (1994), cho thấy việc chuyển đổi R- plasmid đã được phát hiện từ những chủng A. hydrophila kháng thuốc phân lập trên cá ở Thái Lan. Và trong nghiên cứu này tác giả cũng cho thấy hầu hết vi khuẩn kiểm tra kháng với 19 loại kháng sinh đã thử nghiệm. Ngoài ra, tác giả còn cho biết kháng sinh sulfamonomethoxine và tetracycline được sử dụng rất thường trong việc trị bệnh cho cá và hầu hết những chủng kháng với