Phương pháp xác định MIC của thuốc lên vi khuẩn bằng phương pháp pha loãng (Geert Huys, 2002. Trích dẫn bởi Huỳnh Thị Phượng Quyên, 2008).
Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị dụng cụ cần thiết và nuôi vi khuẩn
Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường NA ở 280C, ủ qua đêm.
Kiểm tra độ thuần của khuẩn lạc, sau đó dùng que cấy tiệt trùng lấy 5 hoặc nhiều hơn các khuẩn lạc (đã kiểm tra tính thuần) nuôi trong 10ml NB, ủ ở 280C, nuôi qua đêm.
Các bước thực hiện
Chuẩn bị 2 nồng độ kháng sinh gốc từ nguồn kháng sinh nguyên liệu (ống thứ nhất có hàm lượng 1024ppm và ống thứ hai 265ppm). Thuốc phải được pha bằng dung môi phù hợp (theo hướng dẫn của nhà sản xuất).
Pha loãng các nồng độ kháng sinh từ nồng độ kháng sinh gốc, bằng cách giảm 1/2 lần nồng độ từ nồng độ 1024ppm đến 4ppm. Hàm lượng thuốc 512ppm và 256ppm được pha từ ống thứ nhất (1024ppm). Hàm lượng thuốc 128ppm, 64ppm,...,4ppm được pha từ ống gốc thứ 2 (256ppm) bằng cách thêm nước muối sinh lý.
Mật độ vi khuẩn được xác định bằng máy so màu quang phổ và hiệu chỉnh mật độ vi khuẩn bằng môi trường NB cho đạt OD = 0,1 ± 0,02, mật độ vi khuẩn đạt khoảng 108 cfu/ml.
Cho 2ml dung dịch vi khuẩn đã được hiệu chỉnh ở mật độ 108 cfu/ml vào 2ml dung dịch kháng sinh với các nồng độ khác nhau. Khi đó ở mỗi nồng độ thuốc sẽ giảm đi một nửa (Bảng 3.3).
Mỗi nhóm MIC có 1 ống đối chứng âm (2ml NB + 2ml nước muối sinh lý), 1 ống đối chứng dương (2ml dung dịch nuôi vi khuẩn + 2ml nước muối sinh lý).
Mỗi chủng vi khuẩn sau khi điều chỉnh mật độ phải được cấy trên môi trường NA để kiểm tra sự thuần chủng và phải được ủ trong cùng điều kiện với các ống MIC ở 28−300C trong 24 giờ (hoặc khi vi khuẩn trong ống đối chứng dương phát triển).
Đọc kết quả
Trước tiên phải kiểm tra sự thuần chủng của vi khuẩn trên đĩa NA. Nếu phát hiện có sự tạp nhiễm thì không đọc kết quả MIC.
Xác định kết quả bằng cách so sánh độ đục của mỗi ống MIC với ống đối chứng âm (đối chứng âm không bị nhiễm) và đối chứng dương.
Các ống phát triển không liên tục nên loại bỏ. MIC được xác định ở nồng độ kháng sinh thấp nhất mà vi khuẩn không phát triển.
Trường hợp vi khuẩn phát triển ở tất cả các nồng độ thì giá trị MIC được xác định ở ống nghiệm có hàm lượng thuốc mà sự phát triển của vi khuẩn giảm khoảng 80% so với ống trước đó.
Bảng 3.2: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau (cho một chủng)
Số MIC Hàm lượng cuối cùng (ppm) Thể tích dung dịch thuốc (ml) Thể tích vi khuẩn (ml) 1 512 2 (1024ppm; ống 1) 2 2 256 2 (512ppm; ống 2) 2 3 128 2 (256ppm; ống 3) 2 4 64 2 (128ppm; ống 4) 2 5 32 2 (64ppm; ống 5) 2 6 16 2 (32ppm; ống 6) 2 7 8 2 (16ppm; ống 7) 2 8 4 2 (8ppm; ống 8) 2 9 2 2 (4ppm; ống 9) 2