(theo phương pháp của Kirby Bauer, 1966 được trích dẫn bởi Nguyễn Thị
Thuý Hằng, 2008).
Phục hồi vi khuẩn Aeromonas spp và Vibrio spp từ tủ âm 800C, sau đó tiến hành nhuộm Gram kiểm tra tính thuần thì lập kháng sinh đồ.
Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc thuần trên đĩa vi khuẩn cho vào
ống nghiệm chứa 10 ml nước muối sinh lý (0.85% NaCl) đã tiệt trùng. Trộn và xác định mật số dựa vào máy so màu quang phổ, ở bước sóng 610 nm với giá trị OD = 0,1 ± 0,02 thì mật độ vi khuẩn là 108 tế bào/ ml.
Sau khi xác định mật số vi khuẩn thì tiến hành cho dung dịch vi khuẩn lên môi trường thạch.
Dùng tâm bông tiệt trùng nhúng vào dung dịch vi khuẩn, quét đều lên mặt môi trường thạch MHA. Sau đó dùng pel tiệt trùng lấy đĩa thuốc kháng sinh đặt vào đĩa petri sau cho khoảng cách giữa 2 tâm của đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm và khoãng cách giữa tâm đĩa kháng sinh với mép đĩa petri 10-15mm. Mỗi đĩa petri (θ100mm) môi trường đặt tối đa 6 đĩa kháng sinh.
Sau khi hoàn tất việc dán đĩa thuốc kháng sinh, đặt đĩa petri vào tủấm ở điều kiện 28-300C. Sau 24 giờ tiến hành đọc kết quả.
Sử dụng chủng tham khảo Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum,
kết quả trong thí nghiệm được được đọc và so sánh với kết quả có trong tiêu chuẩn của (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2006).
3.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Qua việc sàn lọc kết quả kháng sinh đồ, sẽ chọn 4-5 chủng vi khuẩn để xác
định giá trị MIC đối với 2-3 loại thuốc kháng sinh.
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn dựa trên phương pháp (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2006b) v Các bước tiến hành:
Ø Chuẩn bị môi trường-hóa chất
Vi khuẩn được lấy từ tủ đông -80oC sau khi rã đông thì được cấy lên môi trường TSA, ủ trong tủ ấm từ 28oC sau 24 giờ. Riêng với vi khuẩn đối chứng
E. coli (ATCC 25922) ủở 37oC.
Kiểm tra và ghi nhận các đặc điểm hình thái của vi khuẩn, hình dạng, kích thước màu sắc khuẩn lạc và nhuộm Gram để xác định tính thuần. Nếu vi khuẩn chưa thuần thì tiếp tục tách ròng cho đến khi đạt được đĩa cấy thuần.
Khi vi khuẩn đã thuần, lấy một ít khuẩn lạc trên đĩa TSA cho vào ống nghiệm chứa 5 ml NA, ủở 28oC, trong 18-20 giờ.
Ø Chuẩn bị dung dịch thuốc
Chuẩn bị dung dịch thuốc gốc: Chuẩn bị 2 chai (50 ml) dung dịch thuốc gốc có nồng độ 1024 và 256 µg/ml bằng dung môi thích hợp.
Pha loãng 2 lần các nồng độ: 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256; 512; 1024 µg/ml. pha loãng bằng nước muối sinh lý ( Bảng phụ lục 3)
Chú ý:
Ống nghiệm có nồng độ thuốc 512 và 256 µg/ml sẽ được pha loãng từ
Những ống nghiệm thuốc còn lại 128; 64; 32;….0,25 µg/ml được pha loãng từ dung dịch thuốc gốc 256 µg/ml.
Cần lắc đều dung dịch thuốc trước khi pha loãng các dung dịch thuốc tiếp theo.
Nồng độ thuốc sẽ giảm đi một nữa khi cho dung dịch vi khuẩn vào. Ghi tên thuốc và nồng độ trước khi bắt đầu thí nghiệm.
Ø Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn
Xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm và điều chỉnh mật độ vi khuẩn bằng môi trường NA (không dùng nước cất)
ởđiểm OD = 0,1 (mật số vi khuẩn khoảng 108CFU/ml), sau đó được pha loãng về 105CFU/ml, mỗi chủng vi khuẩn đều được cấy trên môi trường TSA để
kiểm tra sự thuần chủng và được ủ trong điều kiện với các ống MIC. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cho 3 ml dung dịch vi khuẩn vào từng ống nghiệm có chứa 3 ml dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau: 0,25; 0,5…1024 µg/ml (cần lắc đều).
Thí nghiệm có 2 đối chứng:
Đối chứng âm: (3 ml NA + 3 ml nước muối sinh lý).
Đối chứng dương: (3 ml dung dịch vi khuẩn + 3 ml nước muối sinh lý). Tất cả các ống nghiệm được ủở 28oC, trong 20-24 giờ. Riêng với vi khuẩn
đối chứng E. coli (ATCC 25922) ủở 37oC. Ø Đọc kết quả
Kiểm tra sự thuần chủng của vi khuẩn, nếu có tạp khuẩn thì loại bỏ kết quả
hoặc loại ống nghiệm của chủng vi khuẩn nào phát triển không liên tục thì làm lại thí nghiệm.
Đọc kết quả bằng cách so sánh độđục của ống MIC với ống đối chứng âm và dương.
Giá trị nồng độ MIC được xác định là nồng độ thấp nhất của thuốc kháng sinh, ởđó không có vi khuẩn phát triển.
PHẦN IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Cùng với sự phát triển chung của ngành nuôi trồng thuỷ sản. Trong những năm gần đây, cá tra là đối tượng được xem là đang ở bước phát triển mạnh và đặc biệt quan tâm. Hiện nay cá tra không chỉ là đối tượng thuỷ sản riêng ở vùng nước ngọt mà còn được xem là vật nuôi khá phổ biến ở các vùng nước lợ. Về hình thức cũng được người dân cải tiến dần từ quảng canh sang quảng canh cải tiến, rồi đến bán thâm canh và sau cùng là thâm canh nhằm mục đích tăng năng suất nuôi và đáp ứng nhu cầu của thị trường. Song, việc nuôi trồng trên là phát triển tự phát, thiếu hoặc việc quy hoạch ở các địa phương chưa đuổi kịp sự phát triển, vấn đề bảo vệ môi trường sinh thái ở các
địa phương và đặc biệt là ở vùng nuôi trồng thuỷ sản chưa được quan tâm, kỹ
thuật chuyên môn và đặc biệt là việc quản lý dịch bệnh vẫn chưa được chú trọng. Bên cạnh đó, người dân thường có thói quen lạm dụng thuốc kháng sinh trong phòng trị cho động vật thuỷ sản đã tác động xấu đến môi trường sinh thái của thuỷ. Đặc biệt hơn, việc sử dụng thuốc kháng sinh trong thời gian dài sẽ làm phát sinh nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc, đa kháng thuốc. Những chủng vi khuẩn mang đặc tính kháng thuốc này sẽ phát tán theo môi trường nước phát tán đến nhiều nơi, gây tổn hại đến sức khoẻ của người tiêu dùng.
Chính vì lý do trên, thí nghiệm xác định tính kháng thuốc và nồng độ
MIC để xác định, so sánh sự kháng thuốc của vi khuẩn trong môi trường ao nuôi cá tra lâu năm (Cần Thơ) và vùng nước lợ mới được nuôi (Trà Vinh- Bến Tre) nhằm góp phần làm thay đổi cách nhìn về việc sử dụng hoá chất, thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thuỷ sản, góp phần bảo vệ môi trường sinh thái, sức khoẻ cộng đồng.
4.1 Kết quả thu mẫu, phân lập và định danh vi khuẩn
Sau 6 đợt đi thu mẫu đã thu được 39 ao với tổng số chủng vi khuẩn phân lập là 144 chủng. Trong đó tổng số ao thu được ở Trà Vinh: 13 ao, Bến Tre: 6 ao, Cần Thơ 20 ao, tổng số chủng vi khuẩn được phân lập ở Trà Vinh là: 33 chủng trên môi trường GSP-Agar, 25 chủng trên môi trường TCBS; ở
Bến Tre: 8 chủng trên môi trường GSP-Agar, 17 chủng trên môi trường TCBS, ở Cần Thơ: 61 chủng trên môi trường GSP-Agar. Tóm lại, có 102 chủng vi khuẩn được phân lập trên môi trường GSP-Agar và 42 chủng vi khuẩn được phân lập trên môi trường TCBS. Những chủng vi khuẩn được phân lập trên môi trường GSP- Agar là những khuẩn lạc có sắc tố vàng và tạo vòng màu vàng xung quanh khuẩn lạc trên môi trường này (xem phụ lục 4).
Những khuẩn lạc có sắc tố màu đỏ cũng được nghiên cứu bởi Châu Huỳnh Thuỳ Trâm, (2009) với đề tài nghiên cứu sự kháng thuốc của vi khuẩn
Pseudomonas spp trong môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh ở Cần Thơ và vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh, Bến Tre.
Hình 4.1: Đĩa phân lập Aeromonas spp màu vàng(mũi tên) trên môi trường GSP (a) , cấy Aeromonas
spp trên môi trường GSP (b).
Từ 144 chủng vi khuẩn chọn ra 26 chủng mang tính đại diện cho từng vùng và có hình thái khuẩn lạc giống nhau (9 chủng ở Trà Vinh, 8 chủng ở
Bến Tre, 9 chủng ở Cần Thơ) được phân lập trên môi trường GSP- Agar và 42 chủng được phân lập trên môi trường TCBS để phục hồi, nuôi cấy, tách ròng trên môi trường TSA và TSA+, nhuộm Gram để kiểm tra độ thuần, sau đó tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản.
Kết quả cho thấy những chủng được chọn định danh đến giống có khuẩn lạc màu vàng trên môi trường GSP- Agar đều là vi khuẩn Gram âm hình que có tính di động, có khả năng lên men và oxy hoá đường glucose, cho phản ứng oxidase và catalase dương tính. Sau đó tiến hành kiểm tra phản ứng O/129 thì 26 chủng vi khuẩn này đều kháng với O/129 (đường kính vòng vô trùng ≤9 mm) (phụ lục 5). Đồng thời, qua kết quả lập kháng sinh đồ với Ampicillin thì toàn bộ chủng những vi khuẩn này đều không thấy xuất hiện vòng vô trùng (phụ lục 5). Kết luận, 26 chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường GSP- Agar này đều thuộc giống Aeromonas spp.
Những chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường TCBS là vi khuẩn Gram âm hình que. Song, sau khi kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản còn lại (tính di
động, khả năng lên men và oxy hoá đường glucose, phản ứng oxidase và catalase), kiểm tra phản ứng với O/129 đã có 11 chủng thuộc giống Vibrio spp (phụ lục 6).
Sau khi định danh đến giống 26 chủng Aeromonas spp và 11 chủng
Vibrio spp được tiến hành kiểm tra kháng sinh đồ cùng với hai chủng tham (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
khảo Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum trên môi trường MHA, kết quả của chủng chuẩn trong thí nghiệm là phù hợp với kết quả tiêu chuẩn của (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2006).
Hình 4.2: Hình đĩa kháng sinh đồ chủng Aeromonas spp ở Cần Thơ, AM: ampicillin, CHL: chloramphenicol, DO: doxycyclin, OXT: oxytetracyclin, SM: streptomycin, SXT: trimethoprim + sulfamethoxazol.
4.2 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ
4.2.1 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Aeromonas spp ở Cần Thơ
Năm 2007 tổng diện tích nuôi cá tra ở thành phố Cần Thơ là: 1.569,9 ha. Nơi đây được xem là cái noi của nghề nuôi cá tra thâm canh. Với nhiều năm kinh nghiệm Cần Thơđã rất thành công trong lĩnh vực này và thu được sản lượng rất cao. Song vấn đề đáng lo ngại là hầu hết các hộ nuôi cá tra không có ao lắng sử lý nước thải, không có diện tích chứa bùn khi sên vét ao nuôi. Nước thải, bùn trong ao nuôi thải trực tiếp ra sông rạch. Bên cạnh đó việc quản lý dịch bệnh và sử dụng thuốc hoá chất còn lỏng lẻo. Nên hiện tượng phát sinh nhiều vi khuẩn kháng thuốc và đa kháng thuốc là điều không thể tránh khỏi.
Nhìn chung, Cần Thơ có vi khuẩn kháng thuốc cao hơn so với tỉnh Trà Vinh và Bến Tre, trong đó đối với từng loại thuốc SXT, TE, SM vi khuẩn kháng thuốc là 3/9 chủng, 2/9 chủng kháng với DO. Riêng đối với kháng sinh SM thì Cần Thơ có 3/9 chủng kháng, bằng với tỉnh Trà Vinh và thấp hơn tỉnh Bến Tre (5/8 chủng). Bên cạnh đó, vi khuẩn có tính nhạy với kháng sinh cũng chiếm số lượng thấp: 5/9 chủng nhạy với TE, 4/9 chủng nhạy với DO, hai số
lượng này thấp hơn khá nhiều so với tỉnh Trà Vinh, Bến Tre. Song, Cần Thơ
lại có 5/9 chủng nhạy với thuốc SXT, cao hơn ở Bến tre (4/8 chủng) và cũng thấp hơn nhiều so với tỉnh Trà Vinh (8/9 chủng). Bên cạnh đó, Cần Thơ có vi khuẩn trung bình nhạy với từng loại thuốc kháng sinh ở mức khá cao: SM là 5/9 chủng, DO là 3/9 chủng, các thuốc kháng sinh còn lại 1/9 chủng. d AM TE SM CHL SXT DO
8 1 0 5 1 3 4 3 2 5 1 3 1 5 3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 S ố c h ủ n g v i k h u ẩ n CHL SXT DO TE SM Tên thuốc S I R
Hình 4.3: Biểu đồđặc tính kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas spp tại Cần Thơ; R (kháng), I (trung bình nhạy), S (nhạy).
Ngoài ra, số vi khuẩn đa kháng thuốc cũng ở mức cao hơn hai tỉnh còn lại. Trong 9 chủng Aeromonas spp khảo sát đã có 3 chủng đa kháng thuốc (xem bảng 4.1).
Bảng 4.1 : Tính đa kháng thuốc vi khuẩn Aeromonas spp ở Cần Thơ
Kết quả này hoàn toàn phù hợp vì theo kết quả điều tra của Nguyễn Chính (2005) 100% người nuôi được hỏi đều có sử dụng kháng sinh trong các giai đoạn nuôi khác nhau. Qua bảng 4.1 ta cũng nhận thấy vi khuẩn
Aeromonasở Cần Thơ kháng cao với SXT song đây là dạng kháng sinh phối hợp được nhiều người nuôi dùng trị bệnh cho cá trong hiện nay.
Qua đó có thể suy luận, mặc dù hệ vi khuẩn Aeromonas spp nghiên cứu tồn tại trong môi trường nước và bùn nhưng cũng chịu sự tác động rất nhiều thuốc kháng sinh cũng như hệ vi khuẩn đang tồn tại trong cơ thể vật chủ. Theo
Đỗ Thị Hoà (2004) bệnh do nhóm vi khuẩn Aeromonas spp đã gây thiệt hại không kém nghiêm trọng trong nghề nuôi thuỷ sản nước ngọt ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nó chung. Bệnh nhiễm trùng máu (bệnh xuất huyết, đốm
đỏ…) do nhóm vi khuẩn này gây ra và thường gặp ở các động vật thuỷ sản nước ngọt. Theo Từ Thanh Dung và ctv (2005) A. hydrophila là tác nhanh gây bệnh đốm đỏ trên cá tra, basa và có thể sử dụng OXT, DO để trị bệnh này, trong khi đó kết quả nghiên cứu chỉ có 4/9 chủng Aeromonas spp nhạy với DO
Các loại thuốc Số lượng
SXT, DO, TE, SM 1
SXT, DO, TE 1
và 5/9 chủng nhạy với DO. Sự khác biệt này có thể do DO, TE đã được người nuôi sử dụng trong thời gian dài nên đã tạo nên nhiều dòng vi khuẩn kháng thuốc.
Ngoài ra, với kết quả nghiên cứu của Phuong et al., (2005) với 123 chủng vi khuẩn phân lập từ môi trường ao nuôi tại ĐBSCL, hầu hết những chủng này kháng với chloramphenicol (30ug) và tetracyclin (30µg) tỉ lệ
111/123, trimethoprim/sulfadiazine (25µg) (109/123), tỉ lệ kháng này cao hơn nhiều so với kết quả nghiên cứu Aeromonas spp tại Cần Thơ có vi khuẩn kháng TE, SXT có cùng tỉ lệ 3/9 chủng và không kháng với CHL. Bên cạnh
đó, nghiên cứu của (Sarter et al., 2006) kết luận trong số 92 chủng vi khuẩn phân lập từ 3 ao nuôi cá tra khác nhau đã có 17,8% kháng với AM-OTC-SXT- NA, 15,1% kháng với OTC-SXT-NA, 13,7% kháng với AM-C-FT-SXT-NA, 9,6% kháng với AM-FT-OTC, 8,2% kháng với AM-C-FT-OTC-SXT-NA.
Qua đó ta thấy, hiện tượng kháng, đa kháng thuốc của vi khuẩn ở các vùng nuôi cá tra nói riêng, vùng tham gia nuôi trồng thuỷ sản nói chung đang ngày càng gia tăng, đang là mối quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu, là nổi lo của người dân.
4.2.2 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Aeromonas spp ở Trà Vinh
Trà Vinh với vị trí ven biển, trước đây đã phát triển mô hình nuôi tôm sú với tốc độ khá nhanh. Tuy nhiên, do nuôi tự phát thiếu qui hoạch cho nên khó kiếm soát được nguồn giống, thuốc và hoá chất phòng trị bệnh, nguồn nước thải chủ yếu trực tiếp ra sông làm ô nhiễm. Mặc dù, cá tra chỉ mới đươc xem là đối tượng nuôi của tỉnh vào năm 2003 nhưng hiện nay cá tra đã nuôi khá phổ biến ở Trà Vinh.
Hiện nay, đa số vi khuẩn Aeromonas spp trong trong ao nuôi cá tra ở
Trà Vinh nhạy với SXT (chiếm 8/9 chủng) kế đến là DO (7/9), CHL và TE (6/9) và thấp nhất là SM chỉ có 1/9 chủng. Song, vi khuẩn trung bình nhạy và kháng với SM lại ở mức cao (trung bình nhạy là 5/9 chủng và kháng là 3/9 chủng), trong khi đó vi khuẩn trung bình nhạy, kháng đối với từng loại thuốc kháng sinh còn lại (CHL, SXT, TE) ở mức thấp hơn là 2/9 và 1/9 và không có chủng nào kháng với DO.
6 2 1 8 0 1 7 2 0 6 2 1 1 5 3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 S ố c h ủ n g v i k h u ẩ n CHL SXT DO TE SM Tên Thuốc S I R (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 4.4: Biểu đồđặc tính kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas spp tại Trà Vinh.
Kết quả này khá phù hợp với kết quả nghiên cứu của Châu Hồng Thuý (2008) về sự kháng thuốc của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá tra nuôi thâm canh ở tỉnh này là: có 63,3% vi khuẩn nhạy, 20% vi khuẩn trung bình