3.3.2.1 Phương pháp nhuộm Malachite Green (theo phương pháp Lightner, 1996) Lightner, 1996)
Chuẩn bị tiêu bản:
- Tôm lớn: dùng dao mổ giáp đầu ngực của tôm và lấy gan tụy đưa lên lame tán mỏng.
- Tôm giống: dùng pen và kim mũi giáo tách giáp đầu ngực của tôm và lấy gan tụy đưa lên lame tán mỏng (lấy khoảng 25-40 con/mẫu).
- Nhỏ 1 giọt dung dịch malachite green 0.1% lên mẫu, đậy lamella lại - Quan sát các thểẩn MBV trong vòng 5 phút
- Các thểẩn MBV bắt màu xanh, hình cầu đơn lẻ hay kết thành từng chùm.
3.3.2.2 Phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin
a) Phương pháp cốđịnh mẫu (theo phương pháp Lightner, 1996)
Chuẩn bị dung dich Davidson’
s AFA
Bảng 3.1: Thành phần và thể tích của dung dich Davidson’s AFA
Cố định mẫu
Tôm lớn
- Dùng kéo cắt bỏ các phần phụ trên cơ thể tôm như: các chân bơi và chân bò. Sau đó, cắt đôi tôm tại vị trí nối của phần đầu và phần bụng, tiếp tục dùng kéo cắt phần đầu của tôm ra làm đôi theo chiều dọc cơ thể.
- Cho mẫu vừa cắt vào lọ chứa dung dịch cốđịnh.
- Sau khi mẫu được cố định từ 24-48 giờ thì chuyển mẫu sang cồn 50-700 để
bảo quản mẫu (thời gian trữ mẫu trong cồn thì không giới hạn).
Thành phần Thể tích
Ethyl alcolhol 95% 330 ml
Formaline 200 ml
Acid acetic 115 ml
Tôm giống
- Nhúng trực tiếp mẫu vào dung dịch cốđịnh
- Thời gian cốđịnh mẫu từ 12-24 giờ, sau đó chuyển sang cồn 50-700 để bảo quản.
b) Xử lý mẫu
- Đối với tôm giống thì xử lý cả nguyên con
- Đối với tôm lớn: Dùng dao và pen lột bỏ phần vỏ của tôm và cắt tỉa mẫu lại cho đẹp.
- Mẫu mô tôm sau khi cắt cho vào catsset và quy trình xử lý mẫu được thực hiện trong máy xử lý mẫu mô theo Bảng 3.2 (Shreck & Moyle, 1999):
- Sau khi hoàn thành các bước cài đặt chương trình xử lý mô thì tiến hành cho sọt chứa tôm vào lọ số 1 và cho chương trình cài đặt trên vận hành.
Bảng 3.2: Hóa chất sử dụng trong quy trình xử lý mẫu
TT Hóa chất sử dụng Kích cỡ khối mô/Thời gian Mẫu tôm giống Mẫu tôm thịt 1 Cồn 80% 20’ 30’ 2 Cồn 95% 20’ 60’ 3 Cồn 95% 30’ 30’ 4 Cồn 100% 40’ 60’ 5 Cồn 100% 40’ 180’ 6 Cồn 100% 40’ 180’ 7 Cồn 100% 60’ 180’ 8 Xylen 20’ 30’ 9 Xylen 30’ 30’ 10 Paraffin+Xylen (7:3) 60’ 60’ 11 Paraffin+ Sáp ong (1:1) 60’ 60’ 12 Paraffin+ Sáp ong (7:3) 60’ 60’ c) Đúc khối
- Sau quá trình xử lý, mẫu được tiến hành đúc khối. Mẫu mô sẽđược đặt trong một khung cố định bằng inox và tiến hành đúc khối bằng paraffin nóng chảy ở
650C. Định hướng mẫu mô cho đúng, cẩn thận cho paraffin nóng chảy vào khuôn. Đểđảm bảo mẫu được giữđúng vị trí thì cho khuôn đúc qua khu vực làm lạnh để cố định vị trí của mẫu trong khuôn. Khi mẫu được tẩm vào trong paraffin, đặt khuôn nhựa xử lý có kí hiệu mẫu lên trên. Tiếp theo đặt khuôn
mẫu qua ngăn làm lạnh nhanh để paraffin rắn lại, sau đó tách paraffin ra khỏi khuôn.
d) Cắt lát
- Chuẩn bị máy cắt: Đặt dao vào máy cắt, vặn ốc thật chặt. Độ lệch của mũi dao với mặt cắt của khối mẫu tạo thành một góc khoảng 15-30o. Khối mẫu sẽ được cắt thành các lát cắt khi tay quay của máy xoay tròn, sau mỗi vòng xoay sẽ có một lát cắt được hình thành.
- Cắt mẫu: Trước khi tiến hành cắt mẫu phải điều chỉnh độ dày của lát cắt. Có thể bắt đầu những lát cắt 12-16 µm. Sau khi đã cắt bằng mắt khối mẫu và đạt
đến vị trí mong muốn, điều chỉnh độ dày của lát cắt 3-6 µm.
Mẫu được cắt ra thành từng băng dài, cho vào nước ở nhiệt độ 45-500C, làm cho paraffin căng ra, dùng kim mũi giáo tách riêng từng đoạn đạt yêu cầu. Dán từng đoạn này lên lame. Mẫu dán xong đặt lame lên lò nung điều chỉnh nhiệt
độ khoảng 40-500C cho paraffin chảy ra, lúc này mẫu sẻ được dính chặt vào lame.
e) Nhuộm tiêu bản (theo Maye, s có điều chỉnh) gồm các bước sau:
Bảng 3.3: Các hóa chất sử dụng trong quy trình nhuộm mẫu
STT Hóa chất sử dụng Thời gian (phút) 1 Xylen 5 2 Xylen 5 3 Xylen 5 4 Cồn tuyệt đối 1000 5 5 Cồn tuyệt đối 1000 5 6 Cồn 700 2 7 Rửa nước máy 5 8 Haematoxylin 1 9 Rửa nước máy 5
10 1% acid alcohol 10 giây
11 Rửa nước máy 1 12 Eosin 2 13 Cồn 950 5 14 Cồn 1000 5 15 Cồn 1000 5 16 Xylen 5 17 Xylen 5
f) Dán mẫu
Trải một lớp Canada palsam lên tiêu bản, đậy lamelle lên trên để bảo vệ mẫu. Thao tác này cần làm nhanh để tránh sự xâm nhập của hơi nước trong không khí vào miếng mô.
g) Quan sát tiêu bản và đọc kết quả
Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi quang học. Đầu tiên quan sát ở vật kính 10X để đánh giá tiêu bản. Tiêu bản đạt yêu cầu phải có các thể ẩn hình cầu nằm trong nhân bắt màu hồng của Eosin. Các tiêu bản đạt yêu cầu sẽđược quan sát ởđộ phóng đại 40X.
3.3.2.3 Phương pháp PCR (sử dụng kít Duplex MBV–WSSV của Công ty Nam Khoa) Nam Khoa)
a) Thành phần bộ kít
Các ống WSSV- MBV PCR mix (gồm 43 µl Tris HCl, KCl, Tap polymerase, dNTP, UNG, dUTP, mồi xuôi và ngược, MgCl2), đối chứng dương (Plasmid chèn WSSV- MBV- DNA), đối chứng âm (TE 1X) và MBVDNA-IC (Plasmid chèn DNA chứng nội tại)
b) Chuẩn bị mẫu
Mẫu là tôm PL, tôm giống cỡ nhỏ tiến hành lấy khoảng 50 con.
Mẫu tôm thịt: Tiến hành cắt một phần gan tụy của tôm (tổng lượng mẫu không quá 1 gr).
Tất cả các loại mẫu trên có thể lấy mẫu tươi hoặc cốđịnh trong cồn 95%
c) Ly trích ADN từ mẫu tôm
Nguyên tắc
Phương pháp dựa trên nguyên tắc phối hợp cơ học (nghiền), hóa học (NaOH- SDS) và sốc nhiệt để tách chiết ADN của virus từ mẫu vật.
Quy trình thực hiện
- Cho mẫu vật vào ống Eppendorf 1,5 ml, thêm vào 100 µl dung dịch tách chiết, dùng que nghiền nhuyễn mẫu. Sau đó thêm 500- 700 µl dung dịch tách chiết, tiếp tục nghiền cho đến khi mẫu được nghiền nhuyễn hoàn toàn. (nếu thao tác nhiều mẫu thì nên giữ lạnh trên đá cho đến khi chuyển qua bước tiếp theo).
- Chuyển các ống Eppendorf này đến bếp nhiệt khô ở 960 C, giữ yên 5- 10 phút. Sau đó lấy ra và làm lạnh nhanh trong đá vài phút.
- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Sử dụng phần dịch nổi cho phân tích PCR hoặc giữ lạnh trong -200 C (không quá 1 tuần).
d) Quy trình khuếch đại phát hiện WSSV- MBV
- Mẫu phân tích: cho 2 µl dung dịch chiết ADN và 5 µl dung dịch MBVDNA- IC (vortex kỹ) vào 1 ống WSSV-MBV-PCR mix 43 µl.
- Đối chứng dương: cho 2 µl đối chứng dương và 5 µl dung dịch MBVDNA- IC (vortex kỹ) vào 1 ống WSSV-MBV-PCR mix 43 µl.
- Đối chứng âm: cho 2 µl đối chứng âm và 5 µl dung dịch MBVDNA-IC (vortex kỹ) vào 1 ống WSSV-MBV-PCR mix 43 µl.
- Chu kỳ nhiệt: Thực hiện phản ứng trong máy luân nhiệt theo thống số
01 chu kỳ: 40 0C trong 10 phút 01 chu kỳ: 95 0C trong 05 phút 40 chu kỳ: 94 0C trong 30 giây 49 0C trong 30 giây 72 0C trong 60 giây 01 chu kỳ: 72 0C trong 10 phút
e) Đọc kết quả
- Chuẩn bị bản gel: Pha 1,5% Agarose bằng dung dịch đệm TAE 0,5X chai, sau đó đun cho Agarose tan hết (không còn bọt khí), đợi đến khi nhiệt độ giảm xuống còn khoảng 600C cho Ethidium bromide vào lắc nhẹ (nếu đổ gel ở
khuôn gel có thể tích 30 ml thì thể tích Ethidium bromide cần dùng là 2 μl, khuôn có thể tích 120 ml thì thể tích Ethidium bromide cần dùng là 5 μl) để
Ethidium bromide tan đều rồi tiến hành đổ vào bản gel (chú ý không nên đổ
bản gel quá dày, <0,8 cm). Khi bản gel đông lại thì nhẹ nhàng gỡ bỏ các lược trên bản gel, chuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm (cùng loại với dung dịch đã dùng đun Agarose) vào máng điện di cho tới khi ngập bản gel là được.
- Điện di: Dùng giấy Parafin rồi nhỏ khoảng 2–3 μl dung dịch nạp mẫu, hút 10
μl sản phẩn PCR ra nhỏ vào và trộn đều, sau đó cho vào giếng trên bản gel.
Điện di ở hiệu điện thế là 100 volt, trong thời gian 35–40 phút
- Đọc kết quả: Kết quả điện di được ghi nhận bằng máy đọc gel Vilber Lourmat (Pháp). Căn cứ vào thang ADN 1 kb plus ladder để xác định trọng lượng phân tử. WSSV: sản phẩm khuếch đại 526 bp MBV: sản phẩm khuếch đại 195 bp MBVDNA-IC: sản phẩm khuếch đại 232 bp 3.4 Phương pháp xữ lý số liệu Xác định cường độ cảm nhiễm
Theo Lightner và Redman, 1983 (trích dẫn từ Thanh Dung, Trần Thị Tuyết Hoa và Phạm Minh Đức, 2008)chia cường độ cảm nhiễm MBV ra làm 4 mức (tính cường độ theo thị trường quan sát):
• Cường độ cảm nhiễm nhẹ (+): một vài tế bào gan tôm bị nhiễm thể ẩn của virus.
• Cường độ cảm nhiễm trung bình (++): 10-30% tế bào gan tôm bị nhiễm thể ẩn của virus.
• Cường độ cảm nhiễm nặng (+++): 30-60% tế bào gan tôm bị nhiễm thể ẩn của virus.
• Cường độ cảm nhiễm rất nặng (++++): 60-80% tế bào gan tôm bị nhiễm thểẩn của virus.
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả phát hiện MBV trên mẫu tôm giống và tôm thịt bằng phương pháp nhuộm MG, nhuộm H&E và PCR
4.1.1 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp nhuộm MG
Bằng phương pháp nhuộm MG kiểm tra 30 mẫu tôm sú giống nhiễm MBV (Hình 4.1). Trong đó, có 7 mẫu nhiễm nặng chiếm 23% (nhiễm +++), 11 mẫu nhiễm trung bình chiếm 37% (nhiễm ++) và 12 mẫu nhiễm nhẹ chiếm 40% (nhiễm +) (Hình 4.2).
Hình 4.1: Tôm giống bị nhiễm bệnh MBV có kích cở không đều nhau
23% 37% 40% Nhiễm nặng Nhiễm trung bình Nhiễm nhẹ
Hình 4.2: Cường độ nhiễm MBV trên tôm giống khi phát hiện bằng phương pháp nhuộm MG
Dự kiến thu 30 mẫu tôm thịt nhưng do trong quá trình tiến hành không có mẫu tôm thịt bị nhiễm bệnh nên chỉ thu được11 mẫu. Các mẫu tôm thịt được chọn
để phân tích là những tôm có màu tối sẫm, có kích thước và trọng lượng nhỏ
hơn những con trong đàn (Hình 4.3). Bằng phương pháp nhuộm MG đều phát hiện thấy có 11 mẫu nhiễm MBV ở cường đô nhiễm nhẹ (+).
Kết quả phát hiện trên các mẫu nhiễm MBV ở các mẫu tôm giống và tôm thịt cho thấy có các thểẩn hình cầu dạng chùm hay dạng đơn lẻ bắt màu xanh của thuốc nhuộm Malachite Green (Hình 4.4, Hình 4.5 và Hình 4.6) phù hợp với kết quả nhuộm MG của Lightner, 1996.
Hình 4.3: Tôm thịt bị nhiễm bệnh MBV
Hình 4.4: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng MG (mũi tên chỉ thểẩn MBV dạng chùm) (ở vật kính 40X)
Hình 4.5: Kết quả phát hiện MBV trên tôm thịt bằng MG (mũi tên chỉ
thểẩn MBV dạng chùm) (ở vật kính 40X)
4.1.2 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp nhuộm H&E
Đối với tôm giống qua kiểm tra bằng phương pháp nhuộm H&E ở 30 mẫu này có 1 mẫu nhiễm trung bình chiếm 3% (nhiễm ++), 7 mẫu nhiễm nhẹ chiếm 23% (nhiễm +), 16 mẫu không thấy nhiễm MBV chiếm 54% và 6 mẫu không
đọc được kết quả chiếm 20% (Hình 4.6) . 3% 23% 54% 20% Nhiễm trung bình Nhiễm nhẹ Không nhiễm Không đọc được kết quả
Hình 4.6: Cường độ nhiễm MBV trên tôm giống khi phát hiện bằng phương pháp nhuộm H&E
Các mẫu tôm giống phát hiện nhiễm MBV ở phương pháp nhuộm H&E đều có các thể ẩn bắt màu hồng của Eosin phù hợp với kết quả nhuộm H&E của Lightner, 1996 (Hình 4.7)
Đối với tôm thịt kết quả kiểm tra qua 11 mẫu đều thấy tế bào gan tụy có biểu hiện bình thường (Hình 4.8).
Hình 4.7: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp nhuộm H&E (mũi tên chỉ các thểẩn MBV dạng chùm bắt màu hồng của thuốc nhuộm
Eosin) (ở vật kính 40X).
Hình 4.8: Kết quả phát hiện MBV trên tôm thịt bằng phương pháp nhuộm H&E (mũi tên chỉ tế bào gan tụy bình thường (ở vật kính 40X).
Đối với tôm giống khi kiểm tra 30 bằng phương pháp PCR có 23/30 mẫu dương tính (chiếm 77%) và 7/30 mẫu âm tính (chiếm 23%) (Hình 4.10 và Hình 4.11). Còn đối với tôm thịt kết quả kiểm tra bằng PCR có 3/11 dương tính (chiếm 27%) và 8/11 mẫu âm tính (chiếm 73%) (Hình 4.12 và Hình 4.13)
Hình 4.9: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp PCR
Hình 4.10: Kết quảđiện di phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp PCR
Ghi chú: Lược trên và lược dưới (tương tự) có: Giếng M: Thang đo
Giếng 1 : Đối chứng âm Giếng 2 : Đối chứng dương
27%
73%
Mẫu nhiễm virus MBV Mẫu không nhiễm virus
Hình 4.11: Kết quả phát hiện MBV trên tôm thịt bằng phương pháp PCR
Hình 4.12: Kết quảđiện di phát hiện MBV trên tôm thịt bằng phương pháp PCR Ghi chú: Giếng M: Thang đo Giếng 1: Đối chứng âm Giếng 2: Đối chứng dương Giếng 3 đến giếng 13: Mẫu tôm thịt
4.2 So sánh kết quả phát hiện MBV trên mẫu tôm giống và tôm thịt bằng phương pháp nhuộm MG, nhuộm H&E và PCR phương pháp nhuộm MG, nhuộm H&E và PCR
So sánh kết quả phát hiện MBV bằng 3 phương pháp nhuộm nhanh, mô học truyền thống và PCR ở 30 mẫu tôm giống (Bảng 4.1) cho thấy có 8/30 mẫu (chiếm 27%) đều cho kết quả dương tính ở cả 3 phương pháp. Trong đó, ở
phương pháp nhuộm nhanh có 5/30 mẫu nhiễm với cường độ nặng (nhiễm +++) và 3/30 mẫu nhiễm trung bình (nhiễm ++), riêng phương pháp mô học có 7/8 mẫu nhiễm nhẹ (nhiễm +) và 1/8 mẫu nhiễm trung bình (nhiễm ++). 8 mẫu này được kiểm chứng lại bằng phương pháp PCR đều cho kết quả dương tính.
Mặt khác, 22/30 mẫu (chiếm 73%) còn lại thì cho kết quả không đồng nhất khi phát hiện bệnh bằng 3 phương pháp này. Ở phương pháp nhuộm nhanh có 12/22 mẫu nhiễm nhẹ (nhiễm +), 2/22 mẫu nhiễm nặng và 88 mẫu nhiễm trung bình. Riêng phương pháp mô học thì 22 mẫu này hầu như không quan sát thấy thểẩn (16/22 mẫu thấy tế bào gan tụy bình thường và 6/22 mẫu không
đọc được kết quả). Trong khi đó, ở phương pháp PCR có 15/22 mẫu dương tính.
Sở dĩ trong 22 mẫu còn lại có sự sai khác giữa 3 phương pháp có thể là do 2 lý do sau:
Thứ nhất là khi kiểm tra mẫu tôm giống là kiểm tra ở mức độ quần thể nên khi tiến hành phương pháp nhuộm nhanh có thể thực hiện ở những cá thể tôm nhiễm bệnh nặng nhưng khi trữ mẫu lại để tiến hành tiếp 2 phương pháp còn lại thì có thể thực hiện ở những cá thể nhiễm nhẹ hoặc không nhiễm.
Thứ hai là có thể là do kỹ thuật phân tích của người thực hiện phương pháp chưa cao chẳng hạn như ở phương pháp nhuộm MG nếu người kỹ thuật viên chưa có kinh nghiệm trong quá trình quan sát mẫu sẽ rất dễ nhầm lẫn giữa thể ẩn và giọt dầu, hay ở phương pháp nhuộm H&E nếu không cẩn thận trong bất kỳ khâu nào của phương pháp như, cắt mẫu, nhuộm mẫu... thì mẫu mô sẽ
không đọc được kết quả. Mặc khác, ở phương pháp PCR do sử dụng bộ kít Nam Khoa nên kết quả chỉ biết được là mẫu nhiễm dương tính hay âm tính chứ không thể nhận biết được mức độ nhiễm của mẫu là nặng hay nhẹ. Bên cạnh đó, bộ kít này thực hiện với số lượng tôm giống nhiều (50-70 tôm/mẫu) và sử dụng phương pháp ly trích thô để phát hiện bệnh nên còn lẫn nhiều tạp chất do đó cho kết quả phát hiện cũng chưa cao lắm.
Qua kết quả phát hiện MBV bằng 3 phương pháp này ở 11 mẫu tôm thịt (Bảng 4.2) cho thấy có 3 mẫu dương tính ở phương pháp nhuộm MG và PCR, còn ở
phương pháp nhuộm H&E thì hoàn toàn thấy tế bào gan tụy bình thường. Nguyên nhân dẫn đến kết quả ở phương pháp PCR có 8 mẫu âm tính là do