Máy sắc ký lỏng cao áp đợc kết nối với máy tính.Các bớc làm việc với máy sắc ký có thể hình dung nh sau:
-Mở máy tính, mở công tắc máy HPLC -Cài đặt máy :
v=0,7 ml/phút Nhiệt độ : 300C
-Cho chạy đờng nền để ổn định máy -Tiêm mẫu vào máy và chờ kết quả peak
Để xác định đợc hàm lợng của CAP trong mẫu ngời ta dựa vào mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích peak trên đờng chuẩn đã đợc thiết lập sẵn.
Để xác định đờng chuẩn ta chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn đã biết chính xác nồng độ . Cụ thể ở đây chúng tôi chuẩn bị 6 mẫu rồi đo diện tích peak kết quả nh sau:
Nồng độ mg/ml 0,008 0,012 0,02 0,04 0,06 0,08
Dựa vào bảng kết quả trên ta thiết lập đợc đờng chuẩn nh sau:
Để xác định hàm lợng CAP trong mẫu thức ăn tôm cần phải xử lý mẫu và bơm vào máy HPLC. Dựa vào đờng chuẩn và diện tích peak đo đợc ta sẽ tính đ- ợc hàm lợng CAP.
Phơng pháp xác định CAP sẽ chính xác hơn nếu ta sử dụng phơng pháp thêm. Tức là thêm lợng chính xác CAP vào mẫu đo. Nếu trong khoảng thời gian lu mà ta nghi ngờ là peak của CAP diện tích peak tăng tơng ứng khi thêm CAP thì ta khẳng định đợc peak nghi ngờ là peak chính xác của CAP trong mẫu đo.
Trong luận văn này chúng tôi đã khảo sát việc xác định hàm lợng CAP trong mẫu thức ăn tôm. Đồng thời xác định hiệu suất thu hồi CAP bằng phơng pháp sau:
Chuẩn bị 4 mẫu thức ăn tôm trong đó có 1 mẫu trắng và 3 mẫu còn lại thì cho lợng chính xác CAP lần lợt là : 0,03g; 0,05g; 0,07g.
Đo hàm lợng CAP trên HPLC.
2.3.Kỹ thuật chuẩn bị mẫu
Tách chất phân tích CAP khỏi các tạp chất vào dung môi ít phân cực etyl axetat. Loại chất béo bằng chiết lỏng với n-hexan. Làm giàu và làm sạch mẫu bằng phép chiết pha rắn.
-Cách tiến hành:
Chuẩn bị 4 mẫu để đo trên máy HPLC. Trong đó chuẩn bị mỗi mẫu là 50,0 g thức ăn tôm, xay nhỏ .
Mẫu 1: không cho thêm CAP. Mẫu 2: thêm 0,01 g CAP. Mẫu 3: thêm 0,3 g CAP. Mẫu 4: thêm 0,4 g CAP.
Thêm 40 ml etyl axetat nghiền trộn kỹ và siêu âm trong 15 phút. Lọc lấy dịch hữu cơ trên phễu lọc Buchner.
Cất cô chân không đến gần khô (còn gần 1 ml). Hòa tan phần còn lại trong 2 ml metanol và thêm 10 ml dung dịch salin 4%. Chiết hai lần, mỗi lần bằng 15 ml n-hexan bằng phễu chiết. Sau đó chiết với 15 ml etylaxetat làm 2 lần, loại bỏ pha nớc. Cất cô chân không pha hữu cơ đến gần khô. Hòa tan mẫu còn lại bằng 4 ml dung dịch MeOH:H2O 80:20.
-Tiến hành chiết pha rắn:
Rửa cột pha rắn silicagel bằng 3 ml metanol, sau đó luyện cột bằng 3 ml n- ớc. Cho mẫu qua cột, điều chỉnh chân không để tốc độ dòng chảy cỡ 1,5 ml/phút. Hút cho khô cột trong vài phút. Rửa sạch bằng 10 ml MeOH:H2O 5:95(tt/tt). Rửa giải tách CAP bằng 2 ml MeOH:H2O 80:20, thu đợc mẫu phân tích.
Ta có thể biểu diễn quy trình chuẩn bị mẫu theo sơ đồ sau: Mẫu
Nghiền xay
Siêu âm Lọc Bucner Cât cô đuổi dung môi
Dịch
Chiết lấy pha nước
Dịch chiết hữu cơ Cất cô trong chân không
Dung dịch mẫu Chiết pha rắn
Mẫu bơm vào HPLC
Etyl axetat ( 40 ml)
Metanol
Dung dịch salin 4%
n - hexan (để loại chất béo) Etyl axetat
Chơng 3: kết quả và thảo luận 3.1.Các thí nghiệm định tính cloramphenicol:
Thí nghiệm 1: Xác định điểm chảy của CAP. Kết quả là: Từ 149 đến 1530C.
Thí nghiệm 2: Hòa tan 1 viên thuốc Cloramphenicol trong 5 ml etanol 50% (tt/tt), thêm 10 ml dung dịch CaCl2 1% và 50 mg bột kẽm, đun nóng trên cách thủy 10 phút. Lọc dung dịch nóng và để nguội. Thêm 0,1 ml benzoyl clorua và lắc 1 phút. Thêm 0,5 ml dụng dịch sắt (III)clorua 10,5% và 2 ml cloroform, lắc. Lớp nớc có màu đỏ tím nhạt đến đỏ tía.
Thí nghiệm 3: Lấy 1 viên thuốc Cloramphenicol 250mg vào chén sứ, thêm 10g natri cacbonat khan, đốt 10 phút, để nguội. Hoà tan cặn bằng 5 ml dung dịch acid nitric 2M, lọc. Lấy 1 ml dịch lọc, thêm 1 ml nớc. Dung dịch này phải cho phản ứng A của ion clorit. Cụ thể ở đây dùng dung dịch AgNO3 để nhận biết ion Cl- có kết tủa trắng xuất hiện:
Ag+ + Cl- =AgCl
Thí nghiệm 4: Lấy 1 viên thuốc Cloramphenicol 250 mg hòa tan vào etanol rồi cho dung dịch FeCl3 thấy có kết tủa xuất hiện.
Thí nghiệm 5: Lấy 1 viên thuốc Cloramphenicol 250 mg hòa tan vào etanol, cho bột kẽm rồi mới cho dung dịch FeCl3 thấy xuất hiện dung dịch màu vàng đậm.
3.2.Tách và xác định hàm lợng CAP trên thiết bị HPLC 3.2.1. Ảnh hưởng của tốc độ dòng
Tốc độ dòng dung môi phải nhỏ hơn 5 ml/phút với áp suất cực đại lớn hơn 200 bar và nhỏ hơn 10 ml/phút với áp suất cực đại nhỏ hơn 200 bar.
Tốc độ dòng ảnh hởng rất lớn đến thời gian lu của mẫu và vì vậy sẽ ảnh h- ởng đến chiều cao của peak tơng ứng.
Ví dụ: Khi nghiên cứu định lợng CAP nếu đặt tốc độ dòng là 0,8ml/phút thì thời gian lu thờng là gần 3 phút còn nếu tốc độ dòng là 0,7 ml/phút thì thời gian lu là gần 4 phút.
Nh vậy tốc độ dòng càng lớn thì thời gian lu càng nhỏ .
Trong các thí nghiệm của luận văn này trên hệ thống HPLC chúng tôi cài đặt tốc độ dòng là: 0,7 ml/phút
3.2.2. Ảnh hưởng của th nh phà ần dung dịch pha động
Thành phần dung dịch pha động ảnh hởng rất lớn đến kết quả phân tích. Trong thí nghiệm xác định hàm lợng CAP bằng phơng pháp HPLC trong luận văn này chúng tôi dùng pha động là MeOH/H2O là 60/40.
Nếu tỉ lệ pha động này không đợc tuân thủ nghiêm ngặt thì sẽ có tác dụng không tốt đến sự đối xứng của peak và ảnh hởng lớn đến thời gian lu.
Ví dụ : Cũng phép xác định CAP trên cùng một máy HPLC nhng nếu dùng pha động là metanol 100% thì sẽ cho peak kém đối xứng và thời gian lu là 2,272 phút nhng nếu dùng pha động là MeOH/H2O = 60/40 thì sẽ cho peak rất đối xứng và thời gian lu gần 4 phút.
3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ cột tách
Nhiệt độ cột tách có ảnh hởng đến quá trình phân tích vì nó ảnh hởng đến sự chuyển động nhiệt của các phần tử trong mẫu và sự co giãn của cột nhất là đối với khí hậu khá khắc nghiệt của Nghệ An, nhiệt độ ban ngày và ban đêm có chênh lệch lớn.
Hiện nay các máy sắc ký hiện đại thì có trang bị thiết bị điều nhiệt, ta có thể cài đặt cùng một nhiệt độ cho máy trong suốt thời gian phân tích. Vì vậy, đối với các thiết bị HPLC hiện đại thì kết quả phân tích ít bị ảnh hởng bởi nhiệt độ .
Trong các thí nghiệm của luận văn này trên hệ thống HPLC chúng tôi cài đặt nhiệt độ là: 300C.
3.2.4. Ảnh hưởng của phương pháp xử lý mẫu.
Mỗi giai đoạn xử lý mẫu đều ảnh hởng đến kết quả phân tích. Nhất là đối với quy trình xử lý mẫu phức tạp nh phơng pháp HPLC. Trong quy trình xử lý mẫu nếu không tuân thủ các bớc trong quy trình chuẩn sẽ gây ra sai số rất lớn cho kết quả phân tích.
Việc thêm dung môi vào để thực hiện quá trình chiết cũng rất quan trọng nhất là tỉ lệ của dung môi và thứ tự đem dung môi vào mẫu.
Trong phơng pháp xử lý thức ăn nuôi tôm đã nêu mỗi bớc thực hiện phải rất cẩn thận nhất là giai đoạn chiết pha rắn. Nếu cho sai lợng MeOH/H2O thì có thể không thu đợc CAP.
3.2.5. Kết quả xác định Cloramphenicol trong mẫu thức ăn nuôi tôm.
Mỗi mẫu chúng tôi tiến hành đo trên máy HPLC hai lần kết quả nh sau: Mẫu 1:
Lần Diện tích peak
1 6497807
2 6199927
Diện tích peak trung bình=6497807 6199927
2
+
=6348867
Dựa vào đờng chuẩn suy ra nồng độ CAP trong thức ăn tôm là 0,0226 mg/ml.
Vì thể tích sau khi chiết pha rắn thu đợc 2ml mẫu nên ta co thể tính đợc nồng độ của CAP trong mẫu 1 là: 0,0226ì2 =0,0452 mg.
Vì xét trong 50 g mẫu thức ăn nuôi tôm nên khối lợng CAP trong 100 g là 0,0452 mgì2 = 0,0904 mg
Nh vậy % khối lợng CAP trong mẫu thức ăn nuôi tôm là: %CAP=0,0904 10 3 100
100
−
ì ì =9,04.10-5 % Mẫu 2:
Lần Diện tích peak
1 7467373
2 7339276
Diện tích peak trung bình= 7467373 7339276
2
+
=7403324,5
Dựa vào đờng chuẩn suy ra nồng độ CAP trong thức ăn tôm là 0,0264 mg/ml.
Vì thể tích sau khi chiết pha rắn thu đợc 2ml mẫu nên ta co thể tính đợc nồng độ của CAP trong mẫu 2 là:
0,0264-0,0226=0,0038 mg/ml Từ đó suy ra khối lợng CAP trong 2 ml mẫu là: 0,0038ì2 = 0,0076 mg HSTH = 0,0076 1000,01ì = 76% Mẫu 3: Lần Diện tích peak 1 45753448 2 45654668
Diện tích peak trung bình= 45753448 45654668
2
+ =45704058
Dựa vào đờng chuẩn suy ra nồng độ CAP trong thức ăn tôm là 0,1627 mg/ml.
Vì thể tích sau khi chiết pha rắn thu đợc 2ml mẫu nên ta co thể tính đợc nồng độ của CAP trong mẫu 3 là:
0,1627-0,0226=0,1401mg/ml. Từ đó suy ra khối lợng CAP trong 2 ml mẫu là: 0,1401 ì2=0,2802 mg/ml.
HSTH = 0, 2802 100 0,3 ì = 93,4% Mẫu 4: Lần Diện tích peak 1 53378796 2 50016856
Diện tích peak trung bình= 53378796 50016856
2
+
=51697826
Dựa vào đờng chuẩn suy ra nồng độ CAP trong thức ăn tôm là 0,1840 mg/ml.
Vì thể tích sau khi chiết pha rắn thu đợc 2ml mẫu nên ta có thể tính đợc nồng độ của CAP trong mẫu 4 là:
0,1840 - 0,0226 = 0,1614 mg/ml. Từ đó suy ra khối lợng CAP trong 2 ml mẫu là: 0,1614 ì 2 = 0,3228 mg/ml. HSTH = 0,3228 1000, 4ì = 80,7%
Nh vậy độ thu hồi của CAP trong 3 lần xử lý mẫu là: HSTHTB = 76 93, 4 80,7
3
+ + = 83,37%
Để xác định giới hạn phát hiện chúng tôi sử dụng phơng pháp pha loãng nồng độ đến khi không thấy xuất hiện peak thì nồng độ trớc đó đợc coi là nồng độ nhỏ nhất có thể phát hiện ra CAP . Theo phơng pháp này, trên thiết bị HPLC mà chúng tôi đang nghiên cứu có giới hạn phát hiện đến 10-10 mg/ml. Chúng tôi đã lặp lại thí nghiệm 3 lần và kết quả thu đợc là:
Lần Diện tích peak
1 25623
3 18719
Chúng tôi khảo sát độ lặp lại tại nồng độ 0,02 mg/ml và kết quả thu đợc nh sau:
Lần Diện tích peak Lần Diện tích peak
1 892397 6 841550
2 895124 7 857360
3 880589 8 865523
4 882486 9 866629
5 890974 10 856958
Giá trị diện tích peak trung bình:
x= 1 1 n i x n∑= =872959 Độ lệch chuẩn: 1( )2 1 n i n x x s n − − = − ∑ =0,176
Độ lệch chuẩn tơng đối: RSD(%) = S 100
xì = 0,176%
3.2.Thảo luận:
Quá trình thực nghiệm đã đợc hoàn thành với kết quả tốt, những kết quả trên có độ chính xác và độ tin cậy cao, không hề có sự sửa chữa số liệu điều này có thể đánh giá dựa vào peak thực của các mẫu đã đo.
Vì thời gian có hạn nên chúng tôi cha khảo sát đợc một số phơng pháp khác để đối chứng.
Chơng 4: kết luận và đề xuất 4.1.kết luận:
Căn cứ vào nhiệm vụ của đề tài luận văn đã hoàn thành đợc những nhiệm vụ nh sau:
+ Về lý thuyết:
- Lý thuyết về phơng pháp sắc kí lỏng cao áp. - Lý thuyết chung về Cloramphenicol
+Về thực nghiệm:
- Đã nghiên cứu đợc các phản ứng định tính cloramphenicol
- Đã nghiên cứu quy trình xác định hàm lợng cloramphenicol trong mẫu thức ăn nuôi tôm
- Đã xác định hàm lợng lợng cloramphenicol trong mẫu thức ăn nuôi tôm: 9,04.10-5 %
- Đã xác định độ lặp lại của cloramphenicol trong mẫu thức ăn nuôi tôm tại nồng độ 0,02 mg/ml.
- Đã xác định đợc giới hạn phát hiện cloramphenicol trong mẫu thức ăn nuôi tôm:
+Giới hạn phát hiện hệ thống là 2.10-10 +Giới hạn phát hiện phơng pháp là 4.10-10
- Đã xác định đợc độ thu hồi của cloramphenicol trong mẫu thức ăn nuôi tôm là 83,37 %
4.2.đề xuất:
Với kết quả thu đợc trong luận văn này, hy vọng góp phần đánh giá l- ợng d thừa cloramphenicol trong thức ăn nuôi tôm.
tài liệu tham khảo
I. Tiếng Việt
1.N.X. Acmetop (1984). Hóa học vô cơ, tập 2. Nxb ĐH & THCN
2.A.K.Bako (1995). Phân tích trắc quang phần 1-2. Nxb Giáo dục, Hà Nội.
3.Nguyễn Trọng Biểu, Mai Hửu Đua (1974) .Chuẩn bị dung dịch cho phân tích hóa học. Nxb KHKT Hà Nội.
4. Nguyễn Trọng Biểu, Từ Văn Mạc (2002) .Thuốc thữ hữu cơ. Nxb KHKT, Hà Nội.
5.F.Cotton,G, Wilicinson (1984). Cơ sở hóa vô cơ, tâp 2.NXB ĐH & THCN.
6.Nguyễn Tinh Dung (2000). Hóa học phân tích, Phần III Các ph– ơng phơng pháp định lợng hóa học. NXB Giáo dục, Hà Nội.
7. Doeffel (1983). Thống kê trong hóa học phân tích.NXB ĐH & THCN, Hà Nội.
8.Trần Thị Đà, Nguyễn Thế Ngôn(2001). Hóa học vô cơ, tập 2. Nxb Giáo dục, Hà Nội.
9. Phan Đình Châu, Nguyễn Việt Hơng, Từ Minh Koóng, Đỗ Hữu Nghị. Kĩ
thuật sản xuất dợc phẩm, tập 1. Trờng Đại học Dợc Hà Nội.
10.Trần Tứ Hiếu (2002). Hóa học phân tích.Nxb ĐHQG,Hà Nội.
11.Từ Vọng Nghi, Huỳnh Văn Trung,Trần Tứ Hiếu(1986). Phân tích nớc. NXB KHKT, Hà Nội.
12.Hoàng Nhâm(2000). Hóa học vô cơ, tập II. NXB Giáo dục, Hà Nội. 13. Lơng Đức Phẩm (2003). Công nghệ sử lí nớc thải bằng sinh học.NXB Giáo dục, Hà Nội.
14. Hồ Viết Quý (1991). Các phơng pháp phân tích hóa lí. ĐHSP Hà Nội. 15. Hồ Việt Quý (1995). Phức chất phơng pháp nghiên cứu và ứng dụng
trong hóa học hiên đại. ĐHSP Quy Nhơn.
16. Hồ Việt Quý (1999). Các phơng pháp phân tích quang học trong hóa
học. NXB ĐHQG Hà Nội.
18. Hồ Viết Quý, Đặng Trân Phách (dịch), Nguyễn Tinh Dung (hiệu đính) (1995). Hóa học phân tích quang học trong hóa học. nxb ĐHQG, Hà Nội.
19.Hồ Việt Quý (1994). Xử lí số liệu thực nghiệm bằng phơng pháp toán
học thống kê. ĐHSP Quy Nhơn.
20.Hồ Viết Quý (1998). Các phơng pháp phân tích hiên đại và ứng dụng
trong hóa học. Nxb ĐHQG Hà Nội.
21.Hồ Viết Quý (2005). Các phơng pháp phân tích công cụ trong hóa học
hiên đại. Nxb ĐHSP Hà Nội.
22. Nguyễn Đình Triệu (2001), Các phơng pháp phân tích vật lí và hóa lí,
Tập 1. NXB Khoa học và kĩ thuật.
23. Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà (1999), ứng dụng một số phơng pháp
phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử. NXBGD Hà Nội.
24.Đinh Văn Thành(2006), Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định l-
ợng vitamin D trong một số chế phẩm Multivitamin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, Hà Nội
II. Tiếng Anh
25.Hinilicova M., Sommer (1961). 4-(2-pyridilazo)- resorcinol
accelerator mertic chemical indicator . Col. Czech. Chem. Comm. 26, p.2198-
2205.
26. Kimitoshi S, Mitsishita, Takashi G. (1999). Preconcentration of trace
cadmium from water sample using 4-(2- pyridilazo)- resorsinol.
Capriquat loaded silicagel.
27. B. Reanak and J. Korbl (1960). Collecction of czechoslovak chemical
aommunications. Vol.24, N03,p. 797
28. Roston D.A. (1984). Precolumn chelation with PAR for
determination of metal ions by liquid chromatography.Analytical
Chemistry,Vol.56,p.241-244.
29.Siroki M., Marie L., Stefanae Z., Herak M.J. Characterization of
complexes involved in the spectrophotometric determination of cobalt 4-(2- pyridilazo )-resorsinol. Analytical Chimical Acta,Vol.75,p110-109.
30. Shabana Amin (1997) Doctor of philosophy. Kinetic and
thermodynamic aspects of complexation of trivalent metals (Al3+ and Fe3+) by Maltol.
31. Chen,Jiansong, Teo, Khay Chuan (2002). Determination of
cadimium,copper, lead, and zinc in water samples by flame automic absortion spectrometry after cluod point extraction. Analytical Chimical
Acta,450 (1-2), 215-222. Chem.Abs.Vol.136,p.188,936.
32. N.N. Greenwood and A.Earnshaw (1998). Chemitry of the elements. Buttrt worth,Heinemann,p..216-229.
33. Kirk (1992). Othmer encyclopedia of chemical technology. 4 th edn,