Đối tượng nghiờn cứu

b. Sử dụng vi sinh vật hiếu khớ trong Bỡoilter

2.1.1. Đối tượng nghiờn cứu

Vi khuẩn hiếu khớ trong đất.

2.1.2 Điạ điểm nghiờn cứu

- Vườn thực nghiệm trường Đại học Vinh - TP Vinh - Nghệ An - Mẫu nước thải tại kờnh bắc Tp Vinh Nghệ An (nước thải sinh hoạt) - Phõn lập và nghiờn cứu tại phũng thớ nghiệm Vi sinh và Phũng thớ nghiệm trung tõm trường Đại học Vinh.

2.1.3 Thời gian nghiờn cứu

- Thu thập số liệu, tiến hành thớ nghiệm từ thỏng 10 năm 2009 đến thỏng 1 năm 2010.

- Xử lớ số liệu và hoàn thành luận văn từ thỏng 2 năm 2010 đến thỏng 5 năm 2010.

2.2. Phương phỏp nghiờn cứu [1, 2, 7]

2.2.1 Phương phỏp lấy mẫu[7]

+ Phương phỏp lấy mẫu đất - Chọn vị trớ thu mẫu

- Tiến hành thu năm mẫu tại năm vị trớ khỏc nhau

- Mụ̃i vị trớ lấy 250g mẫu đất

+ Phương phỏp lấy mẫu nước thải: Dựng bỡnh nhựa dung tớch 1lit lấy mẫu nước thải tại địa điểm đó lự chọn. Sau đú đậy chặt nắp cho vào tỳi polietilen gúi kớn và bảo quản ở tủ lạnh ở 0 - 4o C

2.2.2 Phương phỏp hộp trải [7]

- Dựng pipetman và que trang vụ trựng, thao tỏc vụ trựng chuyển 1ml huyền phự chứa giống vi sinh vật lờn bề mặt mụi trường trong đĩa Petri.

- Vụ trựng que trang bằng cồn 70oC và trờn ngọn lửa đốn cồn. - Dựng que trang trang đều mẫu trờn bề mặt mụi trường nuụi cấy. - Nuụi vi sinh vật ở nhiệt độ 30oC cho đến khi hỡnh thành khuẩn lạc.

2.2.3 Phương phỏp phõn lập và mụ tả đặc điểm khuẩn lạc [2, 7]

Vi khuẩn khi phỏt triển trờn cỏc bề mặt mụi trường đặc sẽ hỡnh thành khuẩn lạc đặc trưng cho mỗi loài. Dựa vào đú nghiờn cứu những đặc điểm của khuẩn lạc.

Những đặc điểm cần quan tõm đú là:

+ Hỡnh dạng khuẩn lạc: Trũn, hỡnh amớp, hỡnh rể... + Thời gian xuất hiện khuẩn lạc: Từ 24h trở đi + Màu sắc: Xanh, đỏ, tớm, vàng, trắng, sữa, trong... + Mộp khuẩn lạc: Trũn, bong, xự xỡ...

+ Bề mặt của khuẩn lạc; Trơn, phẳng, lồi, lừm...

2.2.4 Phương phỏp xỏc định hàm lượng chất hữu cơ trong nước thải (theo

TCVN) - Phương phỏp kali pemanganat [8]

a. Nguyờn tắc

Dựa vào khả năng oxi hoỏ mạnh của kali pemanganat cho mẫu thử tỏc dụng với kali pemanganat để oxi hoỏ mẫu thử. Dựa vào lượng KMnO4 cho vào mẫu thử và lượng cũn lại sau khi oxi hoỏ cú thể tớnh được lượng chất hữu cơ.

b. Cỏc ion cản trở và cỏch khử

Sắt cũng phản ứng với KMnO4, do đú phải lọc kĩ mẫu nước cú sắt (II) trước khi xỏc định tạp chất hữu cơ.

Muối amoni hoặc ammoniac hoà tan cũng cản trở phộp xỏc định. Muốn loại ammoniac đem đun núng mẫu thử trước khi xỏc định.

Cho lượng bạc oxit thu được vào 110 ml mõ̃u thử, để yờn 2h và lọc. hứng lấy dịch lọc để xỏc định tạp chất hữu cơ.

c. Thuốc thử và cỏc dung dịch

Axit oxalic nồng độ 0,1N.

Hoà tan 4,5g axit oxalic voà ớt nước cất 2 lần, lắc cho tan, sau đú thờm nước cất đến 1000ml. Khi cần để lõu cho thờm một ớt thuỷ ngõn Iotđua

Kali pemanganat, dung dịch 0,1N.

Cõn chớnh xỏc 3,160g kali pemanganat, hoà tanlượng cõn vào một ớt nước cất, thờm nước đến 1000ml, lắc đều, đun sụi dung dịch trong một giờ, để yờn một tuần và lọc qua màng lọc thuỷ tinh xốp.

Xỏc định và hiệu chỉnh nồng độ dung dịch kali pemanganat theo dung dịchixit oxalic 0,1n.

Cho 10ml dung dịch axit oxalic 0,1N vào bỡnh nún dung tớch 250ml, thờm 100ml nước cất hai lần và 2ml axit sunfuric đậm đặc (d = 1,84). Đun sụi lượng chứa trong bỡnh và giữ sụi 10 phỳt. Dung buret đưngh dung dịch kali pemanganat 0,1n để chuẩn độ. Khi dung dịch trong bỡnh nún cú màu phớt hồng thỡ dừng lại. nếu lượng kali pemanganat hết đỳng 10ml, thỡ dung dịch cú nồng độ đỳng 0,1n.

Axit sunfuric đậm đặc (d = 1,84).

d. Tiến hành xỏc định

Cho vào bỡnh nún dung tớch 500ml đó được rửa sạch và sấy khụ 100ml nước cần thử (khi nồng độ chất hửu cơ quỏ lớn phải giảm bớt lượng mẫu thử), thờm vào 2ml axit sunfuric đõm đặc (d = 1,84), cho thờm đỳng 10ml dung dịch KMnO4. Sau đú đun sụi 10 phỳt, thờm vào 10ml dung dịch axit oxalic 0,1N lắc đều. Sau đú khi dung dịch cũn núng dung pipet đựng dung dịch KMnO4 0,1N chuẩn độ và ghi lượng KMnO4 đó tiờu tốn (V1).

Thay mẫu nước đem thử bằng 100ml nước cất hai lần để thực hiện một thớ nghiệm trắng và ghi lấy lượng dung dịch KMnO4 đó tiờu tốn (V2). Lượng KMnO4 tiờu tốn thực là hiệu số giữa hai thể tớch KMnO4 tiờu tốn.

e. Tớnh kờ́t quả

1 ml dung dịch KMnO4 0,1N tương ứng với 8mg Oxy.

Lượng Oxy cần để Oxy hoỏ cỏc chất hữu cơ trong 1lit nước (X) tớnh theo cụng thức:

X = (N - n).8.a.1000/100

Trong đú: a:độ chuẩn của dung dịch KmnO4

N: Lượng dung dịch KMnO40,1N tiờu tốn lỳc chuẩn mõ̃u thử (ml) n: Lượng dung dịch KMnO40,1N tiờu tốn lỳc chuẩn màu trắng (ml) Độ chuẩn của kalipemanganat (dựng axit oxalic 0,1N kiểm định).

- Nguyờn tắc: 2KmnO4 + 5 (COOH)2 + 3H2SO4 ---> 2MnSO4 + K2SO4 + 10CO2 + 8H2O

- Húa chất:

+ Axit oxalic 0,1N 10ml. + H2SO4 (tinh khiết) 1 - 2 ml

Đun ở 50 - 60oC. Sau đú chuẩn độ KmnO40,1N đến khi cú màu hồng bền.

- Độ chuẩn của kalipemanganat = 10/V. (N/10)

Trong đú V: số ml KmnO4 0,1N; N: khối lượng riờng của KMnO4 Kết quả: 1N = 158/5 =31,6g  0,1N = 3,16g

2.2.5. Phương phỏp xỏc định hoạt độ phõn giải hợp chất hữu cơ [8]

Mẫu nước chứa trong lọ đầy, nỳt kớn. Trước khi phõn tớch cần trung hoà đến pH = 7 bằng H2SO4 0.1N hoặc NaOH 0,1N.

- Lấy mẫu nước vào 2 bỡnh tam giỏc khụ đó vụ trựng dung tớch 250ml, mỗi bỡnh 10ml.

+ Bỡnh thử nghiệm cho thờm vi sinh vật. + Bỡnh đối chứng khụng cho thờm vi sinh vật.

- Cả 2 bỡnh đều được đậy kớn, để trong tối 5 ngày ở 20oC (sau 24h lắc nhẹ bỡnh một lần)

+ Mở nhanh lắp từng bỡnh cho thờm vào 10ml Ba (OH)2 0,1N rồi đậy kớn nhanh, lắc đều. sau đú cho vào mỗi bỡnh 1 đến 2 giọt chỉ thị màu phenolphthalein, rồi dựng buret đựng H2SO4 0,1N chuẩn độ và ghi thể tớch H2SO4 tiờu tốn.

+ Tớnh kết quả:

- Mẫu thử nghiệm: mg CO2/l = (10 - V1). 0,44. 100/10

- Mẫu đối chứng: mg CO2/l = (10 - V2). 0,44. 100/10

- Trong đú V1, V2 lần lượt là thể tớch H2SO4 chuẩn độ mẫu thử nghiệm và mẫu đối chứng.

Lặp lại thớ nghiệm như trờn 3 lần.

2.2.6. Xỏc định số lượng khuẩn lạc[2, 7]

Cỏc khuẩn lạc được xỏc định số lượng bằng phương phỏp CFU (Colony Forming Unit).

Cú nhiều phương phỏp để định lượng vi sinh vật trong đú phương phỏp đếm số lượng khuẩn lạc trờn mụi trường đặc ở hộp Petri là một phương phỏp phổ biến, theo quy định của Việt Nam và quốc tế (tổ chức kiểm định quốc tế và thực phẩm FDA - Food and Drug Administration).

Số lượng tế bào vi sinh vật cú trong 1g đất hay 1ml được biểu thị bằng đơn vị CFU/g (hay CFU/ml) là số khuẩn lạc được hỡnh thành từ một cơ thể vi sinh vật (tế bào ban đầu trong mụi trường nuụi cấy trong điều kiện phự hợp mà mắt thường khú cú thể quan sỏt được).

Đếm số khuẩn lạc ở cỏc nồng độ pha loóng thập phõn 10-2, 10-3, 10-4,10-5... và mỗi độ pha loóng lặp lại 3 lần.

Tớnh kết quả: Đếm tất cả cỏc khuẩn lạc trờn đĩa sau khi nuụi 72h, chọn cỏc đĩa cú số khuẩn lạc từ 25 - 250 để tớnh kết quả (đối với vi khuẩn, theo quy định của FDA).

Tổng số vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu được tớnh như sau: A (CFU/g hay CFU/ml) = N/ (n1vf1 + n2vf2 +... + nivfi)

Trong đú: A - số tế bào (CFU) vi khuẩn trung bỡnh trong 1g hay 1ml mẫu. N - tổng số khuẩn lạc đếm được trờn cỏc đĩa đó chọn.

ni - số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loóng thứ i. v - thể tớch dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. Fi - độ pha loóng tương ứng.

2.2.7. Phương phỏp theo dừi ảnh hưởng của nhiệt độ, pH lờn sự sinh trưởngcủa vi khuẩn của vi khuẩn

Bố chớ cỏc thớ nghiệm ở điều kiện nhiệt độ và pH thớch hợp với từng thớ nghiệm. Mỗi thớ nghiệm lặp lại 3 lần. Sau đú đo độ đục trờn mỏy quang phổ ở bước súng trung tớnh.

2.2.8. Mụi trường nuụi cấy vi khuẩn hiếu khớ

Mụi trường SPW lỏng gồm: peptone: 1g NaCl: 8,5g Nước: 100ml pH: 7 + - 0,2 Mụi trường SPW đặc cú thờm 2g Agar.

Mụi trường nuụi cấy Pseudomonas cú thờm penicillin (vỡ Pseudomonas cú gen khỏng penicilin) để diệt cỏc VSV khỏc.

2.2.9. Phương phỏp xỏc định tốc độ sinh trưởng theo Blachman (198) [1]

- Sinh trưởng của vi khuẩn (sinh trưởng tương đối). Pd = (D - d)/d.100%

Trong đú: d - số đo đường kớnh khuẩn lạc lần đầu (mm). D - số đo đường kớnh khuẩn lạc lần sau (mm).

- Tốc độ sinh trưởng:

Vp = (D-d)/ (t1 - to)

Chương III

KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tổng vi khuẩn hiếu khớ

Để xỏc định tổng vi khuẩn hiếu khớ theo quy định phải sử dụng phương phỏp CFU (Colony Forming Unit). Cơ sở của phương phỏp này là dịch cú vi sinh vật được pha loóng thập phõn, sau đú cấy vào mụi trường thớch hợp đó vụ trựng và nuụi ở 30oC cho đến khi hỡnh thành khuẩn lạc.

Với phương phỏp này chỳng tụi đó thu được kết quả ở bảng 3.1. Bảng 3.1: Tổng vi khuẩn hiếu khớ

Nồng độ 10-2 10-3 10-4

Đĩa 1 326 298 236

Đĩa 2 318 305 243

Đĩa 3 313 308 228

Qua bảng trờn ta tớnh được vi khuẩn hiếu khớ tổng số:

A (CFU/ml hay CFU/g) = (236 + 243 + 228)/ (0,0001. 3. 1) = 2,36. 106 (CFU/ml)

Từ kết quả này cho thấy ở đõy là: 2,36. 106 (CFU/ml). Như vậy trong 1g đất cú tới 2,36. 106 tế bào vi khuẩn hiếu khớ.

Với kờ́t quả này cho ta thṍy vi khuõ̉n hiờ́u khí trong đṍt khỏ phong phỳ và như vậy ta cú thể khai thỏc để sử dụng vào những mục đớch khỏc nhau, đặc biệt là sử dụng trong việc xử lý mụi trường nước.

3.2. Thành phõ̀n và sụ́ lượng vi khuõ̉n hiờ́u khí được phõn lõ ̣p từ mõ̃u thu

Từ mõ̃u đṍt thu được, chúng tụi tiờ́n hành nuụi trờn đĩa petri chứa mụi trường SPW đă ̣c. Vi khuẩn hiếu khớ trong đất cú rất nhiều chủng, cỏc chủng

cú những đặc tớnh rất khỏc nhau. Do đú cần nghiờn cứu về số lượng và thành phần của chỳng.

Từ những khuẩn lạc xuất hiện sau một thời gian nuụi cấy, chỳng tụi nghiờn cứu đặc điểm của chỳng và kết quả thu được ở bảng 3.2:

Bảng3.2: Đặc điờ̉m các chủng vi khuõ̉n hiờ́u khí phõn lọ̃p được.

Chủng Thời gianxuất hiện Hỡnhdạng Màu sắc Dịch tiết Bề mặt

C1 24h Trũn Vàng đậm Khụng cú Trơn lừm ở giữa C2 48 Trũn Xỏm Trắngđục Lồi xự xỡ C3 48 Gầntrũn Đen Trắng Lồi xự xỡ C4 72 Trũn Ở giữa đen, xungquanh trắng Trắngtrong Xự xỡ C5 24 Trũn Trắng xanh Khụng cú Trơn, lừm ở giữa C6 24 Trũn Trắng đục Khụng cú Lồi, trơn C7 24 Trũn Trắng đục ở giữamàu đậm hơn Khụng cú Lừm ở giữa C8 24 Trũn Trắng Khụng cú Phẳng trơn C9 24 Trũn Vàng nhạt Khụng cú khụng nhẵnPhẳng

Từ bảng trờn cho thấy:

- Vi khuẩn hiếu khớ trong đất ở đõy cú tới 9 chủng.

- Cỏc chủng này hỡnh thành khuẩn lạc khụng cựng một lỳc. Chứng tỏ khả năng mọc của vi khuẩn ở cỏc chủng là cú sự khỏc nhau.

- Về thời gian xuất hiện khuẩn lạc:

+ Chủng xuất hiện muộn nhất là: C4 sau 72h.

+ Chủng cú thời gian xuất hiện khuẩn lạc trung bỡnh là: C2, C3 sau 48h. Từ đõy cho thấy, nhỡn chung là cỏc chủng vi khuẩn hiếu khớ xuất hiện sau 24h. Tuy nhiờn vẫn cú loài xuất hiện muộn hơn. Về hỡnh thỏi khuẩn lạc: Nhỡn chung tất cả cỏc khuẩn lạc đều cú dạng trũn và gần trũn.

- Về màu sắc của khuẩn lạc: Ta thấy mỗi chủng cú một màu sắc khỏc nhau vàng, đen, xỏm, trắng... Điều này cho thấy sự phong phỳ và đa dạng của vi khuẩn hiếu khớ trong đất.

- Về dịch tiết của khuẩn lạc: ta thấy cú loài cú dịch tiết, cú loài khụng cú và dịch tiết cũng khỏc nhau như: trắng, trắng đục, trắng trong, điều này cho thấy khả năng dinh dưỡng của cỏc chủng khỏc nhau là khỏc nhau.

- Về bề mặt khuẩn lạc: cỏc chủng cú sự khỏc nhau về bề mặt. Một số chủng cú sự giống nhau về bề mặt như: C1 và C5; C2 và C3 điều này cho thấy cỏc chủng này cú thể cú quan hệ gần gũi với nhau.

Như vậy từ đõy ta thấy vi khuẩn hiếu khớ trong đất đa dạng và phong phỳ cả về số lượng và chủng loại. Điều này rất cú lợi cho việc khai thỏc và sử dụng chỳng vào cỏc mục đớch khỏc nhau, đặc biệt là sử dụng vào xử lý nước thải.

3.3. Sự sinh trưởng của các chủng vi khuõ̉n hiờ́u khí phõn lõ ̣p được

Như chỳng ta đó biết mỗi loài vi sinh vật cú khả năng sinh trưởng và phỏt triển khỏc nhau. Việc nghiờn cứu sự sinh trưởng và phỏt triển của chỳng cú ý nghĩa rất lớn, giỳp chỳng ta biết được chủng nào sinh trưởng nhanh hơn và đưa ra được điều kiện tối thớch cho chỳng sinh trưởng, phỏt triển nhằm phục vụ những mục đớch nghiờn cứu và sử dụng khỏc nhau. Chớnh vỡ vậy chỳng tụi đó tiến hành nghiờn cứu sinh trưởng của cỏc chủng vi khuẩn hiếu khớ phõn lập được ở điờ̀u kiện: 30o

C; pH = 7; trờn mụi trường SPW đă ̣c.

Cỏc chỉ tiờu được quan tõm bao gồm: Đường kớnh khuẩn lạc đo lần đầu (d), đường kớnh khuẩn lạc đo lần sau (D) và sinh trưởng tương đối (P%)... Kết quả thu được ở bảng 3.3.

Bảng 3.3: Sinh trưởng phát triờ̉n của các chủng vi khuõ̉n hiờ́u khí (C1 -> C9) ở 30oC; pH = 7

Cỏc chủng Thời gian(h) Cỏc chỉ tiờu

d (mm) D (mm) P% C1 48 - 72 6,03 6,86 13,8% C2 48 - 72 2,03 2,74 34,8% C3 48 - 72 5,13 5,92 15,4% C4 48 - 72 3,86 4,32 17,4% C5 48 - 72 3,46 4,01 15,9% C6 48 - 72 3,70 4,30 16,2% C7 48 - 72 4,50 5,20 15,6% C8 48 - 72 5,01 6,03 20,4% C9 48 - 72 3,83 4,62 20,6%

Từ bảng trờn cho thấy: Thời gian theo dừi bắt đầu từ 48h và sau đú là 72h trờn cựng một mụi trường, thỡ cỏc chủng vi khuẩn hiếu khớ cú sự khỏc nhau về kớch thước và tốc độ sinh trưởng. Núi cỏch khỏc mỗi chủng cú một tốc độ sinh trưởng riờng, trong đú:

+ Chủng cú sự sinh trưởng và tốc độ lớn nhất là: chủng C2. + Chủng cú sự sinh trưởng và tốc độ thỏp nhất là: C1.

+ Cỏc chủng cú sự sinh trưởng và tốc độ trung bỡnh là:C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9. Cỏc chủng này sinh trưởng tương đối đều nhau dao động từ 15,4% ->20,6%

Cú sự khỏc nhau về sinh trưởng là do mỗi loài sinh vật cú khả năng trao đổi chất và chuyển húa năng lượng khỏc nhau, mỗi loài cú ưu thế sử dụng một loại chất khỏc nhau để làm thức ăn.