CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
❖ Tiêu chuẩn lựa chọn nhóm bệnh:
- Tất cả bệnh nhân ung thư biểu mô dạ dày được khám lâm sàng, có kết
quả xét nghiệm cận lâm sàng, chẩn đốn hình ảnh và chẩn đốn xác định bằng tiêu chuẩn mô bệnh học.
- Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân
+ Bệnh nhân, gia đình bệnh nhân khơng đồng ý tham gia nghiên cứu. + Bệnh nhân có kết hợp các bệnh lý ung thư khác.
❖ Tiêu chuẩn lựa chọn nhóm chứng:
Những cá thể khơng mắc ung thư dạ dày được xác định qua khám lâm sàng và nội soi dạ dày với kết quả nội soi dạ dày là bình thường hoặc viêm trợt cấp tính, ghép cặp với nhóm ung thư dạ dày theo tuổi, giới.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
❖ Thiết kế nghiên cứu bệnh – chứng
❖ Cỡ mẫu:
Cỡ mẫu nghiên cứu được tính tốn dựa trên phần mềm OpenEpi. Đây là một phần mềm miễn phí với rất nhiều chức năng phân tích được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu dịch tễ bao gồm cả chức năng tính tốn cỡ mẫu nghiên cứu [128]. Với tỷ lệ bệnh:chứng là 1:1 trong đó tỷ lệ nhóm bệnh và nhóm chứng mang kiểu gen nguy cơ được dựa trên kết quả nghiên cứu của
Fang Li và cs (2012) nghiên cứu về đa hình gen MUC1 và gen PSCA trên
Kết hợp dữ liệu từ nghiên cứu và phần mềm tính tốn trên chúng tơi thu
được cỡ mẫu tối thiểu cần thiết cho nghiên cứu này là 139 bệnh nhân ung thư
dạ dày và 139 đối tượng không ung thư dạ dày làm đối chứng.
Trong q trình nghiên cứu, chúng tơi lựa chọn được 302 bệnh nhân và
304 đối tượng không ung thư dạ dày làm đối chứng với tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ kể trên.
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
❖ Thời gian nghiên cứu: Từ 1/2016 đến 8/2018
❖ Địa điểm nghiên cứu:
- Địa điểm lấy mẫu: Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, Bệnh viện K, Bệnh
viện Trung ương Quân đội 108. - Địa điểm phân tích mẫu:
Phân tích gen được thực hiện 406/606 mẫu tại Trung tâm Kiểm chuẩn và
Đảm bảo chất lượng Xét nghiệm – Đại học Y Hà Nội và 200/606 mẫu tại Khoa sinh học ứng dụng (Viện công nghệ Kyoto, Nhật Bản) bằng cùng
phương pháp. Lựa chọn ngẫu nhiên khoảng 60 mẫu trong 606 mẫu (tương đương 10% tổng số lượng mẫu) được phân tích lặp lại ở cả hai Trung tâm để đảm bảo độ chính xác của kết quả.
Thực hiện định lượng IgG H.pylori bằng phương pháp ELISA tại Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein và Bộ mơn Hóa sinh –Trường Đại học Y Hà Nội.
Thực hiện định lượng Pepsinogen I, II trên hệ thống hệ thống máy miễn dịch tựđộng tại Khoa xét nghiệm – Bệnh viện Đại học Y Hà Nội.
2.4. Các biến số nghiên cứu và cách thức thu thập số liệu
❖ Thu thập mẫu nghiên cứu
- Bước 1: Lựa chọn đối tượng nghiên cứu theo các tiêu chuẩn được đề cập ở phần trên. Phỏng vấn trực tiếp bệnh nhân trong thời gian 30-45 phút
bằng bộ câu hỏi nghiên cứu (phụ lục 1). Các thông tin được thu thập bao gồm
tuổi, giới, trình độ học vấn, nghề nghiệp, tiền sử bệnh lý dạ dày cả nhân, tiền sử UTDD gia đình, tiền sử hút thuốc lá, uống rượu... Các thông tin về đặc điểm chẩn đoán bệnh được thu thập từ Hồ sơ bệnh án của mỗi bệnh nhân.
- Bước 2: Thu thập mẫu máu của bệnh nhân: Mỗi bệnh nhân được lấy 2mL máu vào ống chống đơng EDTA để phân tích gen, 2mL máu vào ống lấy huyết thanh/huyết tương để thực hiện các xét nghiệm định lượng pepsinogen, kháng thể kháng H.pylori.
- Bước 3: Lưu trữ và vận chuyển mẫu máu trong hộp vận chuyển nhiệt
độ 2-4 độ C tới phòng nghiên cứu. Các mẫu bệnh phẩm sẽ được nhận, mã
hóa, xử lý mẫu và lưu trữ trong tủ -20 độ C đến khi phân tích.
❖ Nội dung các biến số nghiên cứu
- Tình trạng hút thuốc lá: được chia thành 2 nhóm là nhóm đối tượng có hút thuốc lá và nhóm đối tượng khơng hút thuốc lá. Theo khái niệm của Trung tâm y học dự phòng Hoa Kỳ CDC (Centers for Disease Control and
Prevention), người hút thuốc lá là người đã từng hút ít nhất 100 điếu thuốc lá
trong đời. Còn người không hút thuốc lá: Là người chưa từng hút thuốc lá hoặc hút ít hơn 100 điếu thuốc trong đời [130].
- Tình trạng sử dụng rượu được đánh giá dựa trên tiêu chuẩn của WHO.
Trong đó WHO đưa ra một đơn vị uống chứa 10 gam cồn là một đơn vị rượu chuẩn. Một đơn vị chuẩn này tương đương với 1 chén rượu mạnh/Whisky (40
độ, 30 ml); 1 ly rượu vang (13,5 độ, 120 ml); 2/3 chai hoặc một lon bia (330 ml) (phụ lục 3). Bộ câu hỏi nghiên cứu được xây dựng dựa theo Test Audit C
được tổ chức y tế thế giới WHO với người uống rượu đến mức có hại khi tổng điểm 3 câu hỏi ở nam giới ≥ 4 điểm vàở nữ giới ≥ 3 điểm, [131]. Người uống
rượu. Còn lại những bệnh nhân không uống rượu hoặc uống rượu ở mức độ
thấp hơn được gọi là khơng có tiền sử uống rượu.
- Tiền sử bệnh lý dạ dày cá nhân: Thu thập dựa trên câu hỏi phỏng vấn về tiền sử bệnh lý dạ dày mà bệnh nhân đãđược bác sỹ chẩn đốn.
- Tiền sử UTDD gia đình: Thu thập dưạ trên câu hỏi phỏng vấn, trong đó người có tiền sử UTDD gia đình khi các thành viên cùng huyết thống khác có
tiền sử bịUTDD (được chẩn đốn tại bệnh viện).
- Tiền sử nhiễm H.pylori được đánh giá dựa trên khai thác tiền sử được
chẩn đoán nhiễm H.pylori của bệnh nhân, thông tin thu thập từ hồ sơ bệnh án và kết quả xét nghiệm định lượng IgG H.pylori. Bệnh nhân có tiền sử nhiễm
H.pylori nếu 1 trong 3 kết quả trên làdương tính. Bệnh nhân khơng có tiền sử
nhiễm H.pylori nếu cả 3 kết quả trên là âm tính.
2.5. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu
2.5.1. Trang thiết bị và dụng cụ
- Lị vi sóng (Samsung) - Tủ lạnh (Samsung)
- Tủ lạnh sâu: -20°C; -80°C (Sanyo) - Máy ly tâm đểbàn Eppendorf (Đức) - Máy Voltex-Genie 2
- Máy quang phổ kế Nano drop 2000C - Máy ủ Thermomixer comfort
- Máy PCR Mastercycler pro S của hãng Eppendorf - Đức - Máy điện di Consort EV243
- Máy soi gel và chụp ảnh tự động Gel Doc-It2 Imager - Nồi hấp ướt (Hirayama)
- Tủ sấy (Memmert)
- Tủ ấm nuôi cấy 370C - Cân điện tử
- Máy Elisa Biora iMarkTM
- Máy Hóa sinh miễn dịch tự động Abbott - C16000.i200 (Mỹ)
- Đầu cơn các loại thể tích, ống eppendorf thể tích 1,5 mL và 0,2 mL được hấp ướt ở120 độ C trong vòng 20 phút đểđảm bảo vô trùng trước khi sử dụng.
2.5.2. Hóa chất
- Exgene™ Blood SV Kit (Gene All, Korea). - Ethanol 100% và ethanol 70%.
- Taq polymerase Master Mix 2X (NEB) - Nước PCR - Qiagen (free DNA)
- Agarose
- Dung dịch đệm TBE 10X - Blue Loading Dye 10X - Ethidium bromide - 100 bp DNA ladder
- BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencin Kit.
- Bộ hóa chất định lượng Pepsinogen I và Pepsinogen II – Abbott (Mỹ) - Kit định lượng IgG H.pylori –IBL International GMBH (Đức)
2.5.3. Các cặp mồi và enzym cắt giới hạn trong nghiên cứu
❖ Mồi sử dụng trong nghiên cứu
Bốn cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu đều được tổng hợp bởi công ty IDT – Mỹ.
- 3 cặp mồi dùng để khuếch đại rs4072037, rs2070803, rs2294008
được nhóm nghiên cứu tự thiết kế dựa trên công cụ hỗ trợ thiết kế mồi của NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/).
- Cặp mồi cuối cùng dùng để khuếch đại rs2976292 được thiết kế dựa trên nghiên cứu của tác giả Lu và cs (2010) [17].
Bảng 2.1. Trình tự mồi của phản ứng PCR
Gen Trình tự mồi Kích thước
đoạn DNA
Rs4072037 5’-AACCCAGGGGTTACTGAGGCTG-3’
5’-AGTACGCTGCTGGTCATACTCAC-3’(mồi ngược) 332 bp
Rs2070803 5’-CTTAGCTGTCCGGGTGTGAAGT-3’
5’-TGTGGTTCTAGGCAGGAGCAAC-3’ (mồi ngược) 442 bp Rs2294008 5’-TAGGCTCTGTCCTCCAGAG-3’
5’-TCTGTCTACCTGCCCCCTAG-3’ (mồi ngược) 545 bp RS2976392 5’-CTGGCCATCTGTCCGCAGCT-3’
5’-CAGATGGAGGAGGATGGCTGGA-3’ (mồi ngược) 117 bp
- Tất cả các cặp mồi sau khi được tổng hợp đều được chuẩn hóa để tạo ra phản ứng PCR tối ưu nhằm khuếch đại được đoạn DNA có chứa các SNP
đặc hiệu.
❖ Enzym cắt giới hạn:
Lựa chọn enzym cắt có hai yêu cầu đó là enzym cắt phải cắt đúng được ở
vị trí của SNP, các đoạn DNA sau phân cắt có kích thước khác biệt nhau đủ
để phân biệt được trên kết quả điện di và đảm bảo chất lượng khi thực hiện
phản ứng enzym cắt giới hạn. Các enzym cắt sử dụng trong nghiên cứu đều
được sản xuất bởi hãng New England BioLabs, Beverly, MA, USA.
- Ba enzym cắt được sử dụng để xác định các SNP rs4072037, rs2294008 và rs2976392 dựa vào kết quả nghiên cứu trước [7], [17]. Enzym cắt để xác định SNP rs2070803 là TaqαI được xác định nhờ phần mềm NEBcutter ver 2.0 (http://nc2.neb.com/NEBcutter2/).
Bảng 2.2. Các enzym cắt giới hạn và vị trí cắt của chúng
Enzym
cắt AlwNI TaqαI NlaIII PvuII
Trình tự cắt 5’…CAGNNN*CTG…3’ 3’…GTC*NNNGAC…5’ 5’…T*CGA…3’ 3’…AGC*T…5’ 5’…CATG*…3’ 3’…*GTAC…5’ 5’…CAG*CTG…3’ 3’…GTC*GAC…5’ SNP Rs4072037 Rs2070803 Rs2294008 Rs2976392
Gen Gen MUC1 Gen PSCA
Tất cả enzym cắt sau khi được tổng hợp đều được chuẩn hóa phản ứng cắt tối ưu nhằm xác định được các kiểu gen tương ứng của mỡi SNP.
2.6. Quy trình kỹ thuật phân tích đa hình đơn nucleotid của gen MUC1 và gen PSCA gen PSCA
❖ Tách chiết DNA từ máu toàn phần
DNA được tách chiết từ máu toàn phần bằng Exgene™ Blood SV Kit
(Gene All, Korea) theo quy trình khuyến cáo của nhà sản suất gồm 5 bước: - Bước 1: Ly giải tế bào và nhân bởi muối chaotropic.
- Bước 2: Gắn acid nucleic lên màng silica.
- Bước 3: Rửa bỏ muối chaotropic và thành phần khác như protein,
polysaccarid.
- Bước 4: Làm khô bằng ly tâm.
- Bước 5: Rửa để giải phóng DNA ra khỏi màng silica.
❖ Kiểm tra nồng độ vàđộ tinh sạch của DNA
- Lấy 2 µl sản phẩm DNA tách chiết để kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ
DNA bằng phương pháp đo mật độ quang OD bằng máy Nano Drop 1000 (Thermo).
- Điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,8%. Kết quả mẫu DNA tách từ
❖ Xác định đa hình gen bằng phương pháp RFLP - PCR
- Bước 1. Dùng phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen chứa SNP.
Công thức phản ứng PCR được thể hiện trong Bảng 2.4 và chu kỳ nhiệt của các phản ứng PCR. Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR Thành phần Thể tích/phản ứng Taq Master 2X 15,0 µl Mồi F 0,6 µl Mồi R 0,6 µl
Water nuclear free 10,8 µl
DNA 3,0 µl
Tổng thể tích 30,0 µl
Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR
Thời gian Nhiệt độ Rs4072037 Rs2070803 rs2294008 rs2976392 5 phút 94ºC 94ºC 94ºC 94ºC 30 giây 94ºC 94ºC 94ºC 94ºC 30 giây 60ºC 58ºC 60ºC 63ºC 30 giây 72ºC 72ºC 72ºC 72ºC 5 phút 72ºC 72ºC 72ºC 72ºC ∞ 15ºC 15ºC 15ºC 15ºC
Kiểm tra sản phẩm PCR: Điện di kiểm tra 3 µl sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%, TBE 1X, ở hiệu điện thế 120 V trong 30 phút, sản phẩm điện di
được nhuộm bằng ethidium bromide. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel
agarose 1,5% được chụp hình bằng máy chụp gel GelDoc- It.
- Bước 2: Ủ sản phẩm PCR với enzym đặc hiệu để xác định kiểu gen Nguyên tắc thực hiện phản ứng enzym cắt: Thực hiện theo đúng quy trình cắt enzym đã được ch̉n hóa. Khi thực hiện phản ứng cắt sẽ thực hiện cùng với các mẫu chứng âm và/hoặc chứng dương đã được xác định trình tự gen trước để đối chiếu
Đọc kết quả sản phẩm sau cắt: Các vạch rõ nét, tương ứng với kích
thước các băng DNA của từng đa hình đơn theo kích thước thang ch̉n. Kết quả cắt của mẫu chứng đúng với kiểu gen đã xác định. Trong trường hợp sản phẩm cắt bị mờ, không rõ cần tìm hiểu nguyên nhân và tiến hành lại bước PCR và thực hiện lại phản ứng cắt.
Rs4072037 (MUC1)
Sau PCR ta sẽ thu được sản phẩm có độ dài 332bp. Sản phẩm này sẽ được xử lý bằng enzym AlwNI với tỉ lệ: 0,3 µl enzym AlwNI, 1 µl buffer
CutSmart, 1,7 µl H2O và 7 µl sản phẩm PCR rồi ủ ở 37oC trong 8 giờ.
Điện di hỗn hợp sau khi cắt bằng gel Agarose 1,5% với hiệu điện thế 130
V trong 30 phút. Các kiểu gen chứa rs4072037 sẽ được cắt thành các đoạn có
kích thước như sau (Hình 2.1):
- Kiểu gen AA: Hình ảnh điện di có 2 băng kích thước 223bp và 109bp. - Kiểu gen AG: Trên hình ảnh điện di có 3 băng 223bp, 109 bp và 332bp. - Kiểu gen GG: Trên hình ảnh điện di có 1 băng kích thước 332bp.
Hình 2.1. Hình ảnh mơ phỏng điện di các kiểu gen của SNP rs4072037 sau khi cắt sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn
Rs2070803 (MUC1)
Sau PCR ta sẽ thu được sản phẩm có độ dài 442bp. Sản phẩm này sẽ được xử lý bằng enzym TaqαI với tỉ lệ: 0,3 µl enzym TaqαI, 1 µl buffer CutSmart, 1,7 µl H2O và 7 µl sản phẩm PCR rồi ủ ở 65oC trong 8 giờ.
Điện di hỗn hợp sau khi cắt bằng gel Agarose 1,5% với hiệu điện thế 130 V trong 30 phút. Các kiểu gen chứa rs2070803 sẽ được cắt thành các đoạn (Hình 2.2):
- Kiểu gen AA: Trên hình ảnh điện di có 1 băng kích thước 442bp.
- Kiểu gen AG: Trên hình ảnh điện di có 3 băng 237bp, 205bp và 442bp. - Kiểu gen GG: Trên hình ảnh điện di có 2 băng kích thước 237bp và 205bp.
Hình 2.2. Hình ảnh mơ phỏng điện di các kiểu gen của SNP rs2070803 sau khi cắt sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn
Rs2294008 (PSCA)
Sau khi thực hiện PCR ta sẽ thu được sản phẩm có độ dài 545bp. Sản phẩm này sẽ được xử lý bằng enzym NlaIII với tỉ lệ: 0,3 µl enzym NlaIII, 1µl buffer CutSmart, 1,7 µl H2O và 7 µl sản phẩm PCR rồi ủở 37oC trong 8 giờ.
Điện di hỗn hợp sau khi cắt bằng gel Agarose 1,5% với hiệu điện thế
130V trong 30 phút. Các kiểu gen của rs2294008 sẽ được cắt thành các đoạn (Hình 2.3):
- Kiểu gen CC: Trên hình ảnh điện di có 1 băng kích thước 545bp.
- Kiểu gen CT: Trên ảnh điện di có 3 băng kích thước 545bp, 335bp, 210bp. - Kiểu gen TT: Trên hình ảnh điện di có 2 băng kích thước 335bp, 210bp.
Hình 2.3. Hình ảnh mơ phỏng điện di sau khi cắt sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn với các kiểu gen của rs2294008
Rs2976392 (PSCA)
Sau PCR ta sẽ thu được sản phẩm có độ dài 117bp. Sản phẩm này sẽ được xử lý bằng enzym PvuII với tỉ lệ: 0,3 µl enzym PvuII, 1 µl buffer
CutSmart, 1,7 µl H2O và 7 µl sản phẩm PCR rồi ủ ở 37oC trong 8 giờ.
Điện di 10 µl sản phẩm sau cắt enzym bằng gel agarose 3%, với hiệu điện thế
90 V trong 80 phút. Đối với kiểu gen đa hình đơn nucleotid rs2976392 sẽ có những kiểu gen như sau (Hình 2.4):
545 bp 335 bp 210 bp
- Kiểu gen GG: Trên hình ảnh điện di có một băng kích thước 99bp.
- Kiểu gen AG: Trên hình ảnh điện di có hai băng kích thước 117bp, 99bp. - Kiểu gen AA: Trên hình ảnh điện di có một băng kích thước 117 bp.
Hình 2.4. Hình ảnh mơ phỏng điện di sau khi cắt sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn với các kiểu gen của rs2976392
❖ Giải trình tự gen
10% số mẫu phân tích được giải trình tự ngẫu nhiên để kiểm tra độ lặp lại của kết quả từ phương pháp RFLP – PCR theo các bước như sau:
- Bước 1: Khuếch đại sản phẩm PCR chứa các đa hình đơn
- Bước 2: Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit tinh sạch sản phẩm PCR