CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu
2.5.1. Trang thiết bị và dụng cụ
- Lị vi sóng (Samsung) - Tủ lạnh (Samsung)
- Tủ lạnh sâu: -20°C; -80°C (Sanyo) - Máy ly tâm đểbàn Eppendorf (Đức) - Máy Voltex-Genie 2
- Máy quang phổ kế Nano drop 2000C - Máy ủ Thermomixer comfort
- Máy PCR Mastercycler pro S của hãng Eppendorf - Đức - Máy điện di Consort EV243
- Máy soi gel và chụp ảnh tự động Gel Doc-It2 Imager - Nồi hấp ướt (Hirayama)
- Tủ sấy (Memmert)
- Tủ ấm nuôi cấy 370C - Cân điện tử
- Máy Elisa Biora iMarkTM
- Máy Hóa sinh miễn dịch tự động Abbott - C16000.i200 (Mỹ)
- Đầu côn các loại thể tích, ống eppendorf thể tích 1,5 mL và 0,2 mL được hấp ướt ở120 độ C trong vòng 20 phút đểđảm bảo vô trùng trước khi sử dụng.
2.5.2. Hóa chất
- Exgene™ Blood SV Kit (Gene All, Korea). - Ethanol 100% và ethanol 70%.
- Taq polymerase Master Mix 2X (NEB) - Nước PCR - Qiagen (free DNA)
- Agarose
- Dung dịch đệm TBE 10X - Blue Loading Dye 10X - Ethidium bromide - 100 bp DNA ladder
- BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencin Kit.
- Bộ hóa chất định lượng Pepsinogen I và Pepsinogen II – Abbott (Mỹ) - Kit định lượng IgG H.pylori –IBL International GMBH (Đức)
2.5.3. Các cặp mồi và enzym cắt giới hạn trong nghiên cứu
❖ Mồi sử dụng trong nghiên cứu
Bốn cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu đều được tổng hợp bởi công ty IDT – Mỹ.
- 3 cặp mồi dùng để khuếch đại rs4072037, rs2070803, rs2294008
được nhóm nghiên cứu tự thiết kế dựa trên cơng cụ hỗ trợ thiết kế mồi của NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/).
- Cặp mồi cuối cùng dùng để khuếch đại rs2976292 được thiết kế dựa trên nghiên cứu của tác giả Lu và cs (2010) [17].
Bảng 2.1. Trình tự mồi của phản ứng PCR
Gen Trình tự mồi Kích thước
đoạn DNA
Rs4072037 5’-AACCCAGGGGTTACTGAGGCTG-3’
5’-AGTACGCTGCTGGTCATACTCAC-3’(mồi ngược) 332 bp
Rs2070803 5’-CTTAGCTGTCCGGGTGTGAAGT-3’
5’-TGTGGTTCTAGGCAGGAGCAAC-3’ (mồi ngược) 442 bp Rs2294008 5’-TAGGCTCTGTCCTCCAGAG-3’
5’-TCTGTCTACCTGCCCCCTAG-3’ (mồi ngược) 545 bp RS2976392 5’-CTGGCCATCTGTCCGCAGCT-3’
5’-CAGATGGAGGAGGATGGCTGGA-3’ (mồi ngược) 117 bp
- Tất cả các cặp mồi sau khi được tổng hợp đều được chuẩn hóa để tạo ra phản ứng PCR tối ưu nhằm khuếch đại được đoạn DNA có chứa các SNP
đặc hiệu.
❖ Enzym cắt giới hạn:
Lựa chọn enzym cắt có hai yêu cầu đó là enzym cắt phải cắt đúng được ở
vị trí của SNP, các đoạn DNA sau phân cắt có kích thước khác biệt nhau đủ
để phân biệt được trên kết quả điện di và đảm bảo chất lượng khi thực hiện
phản ứng enzym cắt giới hạn. Các enzym cắt sử dụng trong nghiên cứu đều
được sản xuất bởi hãng New England BioLabs, Beverly, MA, USA.
- Ba enzym cắt được sử dụng để xác định các SNP rs4072037, rs2294008 và rs2976392 dựa vào kết quả nghiên cứu trước [7], [17]. Enzym cắt để xác định SNP rs2070803 là TaqαI được xác định nhờ phần mềm NEBcutter ver 2.0 (http://nc2.neb.com/NEBcutter2/).
Bảng 2.2. Các enzym cắt giới hạn và vị trí cắt của chúng
Enzym
cắt AlwNI TaqαI NlaIII PvuII
Trình tự cắt 5’…CAGNNN*CTG…3’ 3’…GTC*NNNGAC…5’ 5’…T*CGA…3’ 3’…AGC*T…5’ 5’…CATG*…3’ 3’…*GTAC…5’ 5’…CAG*CTG…3’ 3’…GTC*GAC…5’ SNP Rs4072037 Rs2070803 Rs2294008 Rs2976392