Vật liệu nghiên cứu - PHƢƠNG TIỆN - : PHƢƠNG TIỆN- 123docz.net

CHƢƠNG 2 : PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.2 PHƢƠNG TIỆN

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Giống Nàng Nhen (làm mẹ) và tổ hợp lai NK2 x Nhật 1 (dòng 5, F4, làm cha).

Giống Nàng Nhen và tổ hợp lai NK2 x Nhật 1 (dòng 5, F4) đƣợc cung cấp bởi Phịng thí nghiệm chọn giống Thực vật, ộ môn Di Truyền-Giống Nông Nghiệp, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trƣờng Đại Học Cần Thơ. Giống lúa Nàng Nhen nổi tiếng với mùi thơm ngọt dịu nhƣng c thời gian sinh trƣởng khá dài và yếu rạ. Giống NK2 x Nhật 1 c đặc điểm cứng cây, mềm cơm, ng n ngày.

Bảng 2.1 Một số chỉ tiêu nông học và phẩm chất của cây cha mẹ ban đầu (Bộ môn di truyền và chọn giống Đai học Cần Thơ, 2011)

Tên giống TGST (ngày) Cao cây (cm) Năng suất (tấn/ha) Amylose (%) Protein (%) Độ thuần Nàng Nhen 120-140 140-160 4-5 23-25 8,0±1,4 Thuần NK2 x Nhật 1 90-95 110-130 5-6 12-15 10±1,2 Không

TGST: Thời gian sinh trưởng

2.2.2 Thiết bị và hóa chất

Hóa chất thí nghiệm: Tris-base, Acrylamide, Sodium Dodecyl Sulfate

(SDS), TEMED, Coomassie rillian lue R250,….

Dụng cụ thí nghiệm: ộ nguồn chạy điện di, khung chạy điện di, kính dạng

mini-slab gel, máy ly tâm 14.000 vòng/phút, cân phân tích: Lib101 EG-120G (Nhật), máy l c, lò vi s ng (microwave), máy quang phổ THEMO SPECTRONIC GESSYSTM8, và một số dụng cụ khác..

2.3 PHƢƠNG PHÁP

2.3.1 Phƣơng pháp nghiên cứu

Thực hiện các tổ hợp lai (THL) theo phƣơng pháp lai đơn (IRRI, 1979): Nàng Nhen x (NK2 x Nhật 1).

Bước 1: Trồng cây cha mẹ. Những cây cha mẹ đƣợc trồng riêng từng chậu.

Do Nàng Nhen là giống lúa mùa c thời gian sinh trƣởng dài hơn tổ hợp lai NK2 x Nhật 1 nên đƣợc trồng sớm hơn 10-15 ngày để đảm bảo sự trùng hợp về thời gian trổ.

Bước 2: Khử nhị đực cây mẹ, chọn bông phải trổ khỏi bẹ khoảng 50-60%,

tiến hành vào buổi chiều (4-5 giờ), dùng kéo c t 1/2-1/3 vỏ trấu để lộ ra những túi phấn, dùng kẹp để gấp túi phấn ra. ao cách ly bông lúa đã đƣợc khử đực.

Hình 2.2 Loại bỏ các bao phấn trên hoa lúa cây mẹ và bao cách ly

Bước 3: Lai vào buổi sáng ngày hôm sau (9-12 giờ), c t những bông c

nhiều phấn, mở bao sau đ rủ phấn của những tổ hợp lai cần lai. Sau khi thụ phấn ghi tên tổ hợp lai, ngày lai trên bao lai. ao cách ly trở lại cho đến khi thu hạt.

Bước 4: Theo d i và thu hạt lai F1 (thƣờng khoảng 20-25 ngày sau khi đƣợc

thụ phấn từ cây bố). Sau đ , đem trồng trong nhà lƣới mỗi chậu một cá thể (18 hạt). Sau khi trồng theo d i các chỉ tiêu về chiều cao cây, khả năng nẩy chồi, số chồi hữu hiệu, thời gian sinh trƣởng. Đồng thời, kết hợp trồng cây cha mẹ, mỗi giống trồng 4 các thể, để theo d i so sánh chỉ tiêu nông học. Khi thu hoạch tiến hành đo chiều dài bông, số hạt ch c trên bông và trọng lƣợng 1.000 hạt.

Bước 5: Sau khi chọn đƣợc dòng ƣu tú, chọn ngẫu nhiên 200 hạt thế hệ F1

tiếp tục nhân lên (trồng trong nhà lƣới), trong quá trình trồng ta cũng theo d i các chỉ tiêu nơng học của từng dịng để xem c sự khác biệt với thế hệ F1 và với cây cha mẹ hay không. Sau đ , tiến hành đo độ cứng l ng, chiều dài l ng, đƣờng kính mỗi l ng và một số chỉ tiêu về thành phần năng suất hạt F3.

Bước 6: Chọn đƣợc 9 cá thể c độ cứng cây cao nhất từ 15 cá thể thế hệ F2

đem thử rầy, phân tích phẩm chất hạt (amylose, protein, độ bền gel,…), kiểm tra tính thơm bằng KOH 1,7 , điện di protein tổng số kiểm tra độ thuần của 9 dòng. Chọn đƣợc hai tổ hợp lai ƣu tú đạt đƣợc mục tiêu đề ra.

2.3.2 Phƣơng pháp đánh giá chỉ tiêu nông học và thành phần năng suất

 Chỉ tiêu nông học

- Chiều cao cây khi thu hoạch (cm): Đƣợc đo từ mặt đất đến ch p bông của chồi cao nhất.

- Chiều dài bông (cm): Đo từ cổ bông đến ch p hạt cuối cùng của bông, đo ngẫu nhiên 3 bơng/bụi và tính trung bình.

- Chiều dài từng l ng (cm): Đo khoảng cách giữa 2 đốt lóng liên tiếp nhau và chỉ đo các l ng trên mặt đất. Thứ tự l ng tính từ cổ bơng dần xuống gốc, l ng đầu tiên dƣới cổ bông là l ng thứ nhất, kế tiếp là l ng thứ 2 và l ng cuối cùng là l ng thứ 4 hoặc thứ 5.

- Đƣờng kính l ng (mm): Dùng thƣớc kẹp đo đƣờng kính của từng lóng. - Độ cứng l ng thân: Đƣợc tiến hành bằng máy đo độ cứng IM D ZP-50N (Torque gauges IM D ) vơi độ chính xác ± 0,5 FS.

+ Các cây tiến hành đo phải lột hết bẹ. + Đo khoảng giữa từng l ng.

Hình 2.3 Máy đo độ cứng

ƣớc 1: Chỉnh 2 giá đ với khoảng cách là 5cm. ƣớc 2: Nhấn nút on/off.

ƣớc 3: Sau đ nhấn nút speak.

ƣớc 4: Dùng tay quay, quay cho lƣ i dao lên. ƣớc 5: Đặt l ng thân lúa trên 2 giá đ .

ƣớc 6: Nhấn nút Zero.

ƣớc 7: Dùng tay quay, quay cho lƣ i dao xuống để đo moment lực.

 Thành phần năng suất

Các thành phần năng suất: Tổng số chồi, số chồi hữu hiệu, số hạt ch c/bông, trọng lƣợng 1000 hạt.

- Đếm tất cả số bơng trên mỗi bụi lúa, kí hiệu là (bông). - Đếm tổng số hạt lép, kí hiệu là L (hạt).

- Đếm tổng số hạt ch c/bơng, lặp lại 3 lần kí hiệu là C (hạt).

- Đếm đúng 1000 hạt ch c, cân và quy về ẩm độ 14 , lặp lại 3 lần, kí hiệu là w1, w2, w3 (g). Tất cả trọng lƣợng đều quy về ẩm độ 14% W14%=   86 100 0 0 H W   W0: Trọng lƣợng mẫu lúc cân H0: Ẩm độ mẫu lúc cân W14%: Trọng lƣợng hạt ở ẩm độ 14 (g) Trọng lƣợng 1.000 hạt (g) = 3 3 2 1 w w w   Phần trăm hạt ch c =      hat L hat C hat C 

2.3.3 Phƣơng pháp điện di protein SDS-PAGE (Sodium Doecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoreis) Polyacrylamide Gel Electrophoreis)

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

+ Lấy 10 hạt gạo nghiền mịn, cân chính xác 3 mg tinh bột vào ống tuýt. + Thêm 100 μl dung dịch ly trích vào mỗi ống tuýt, để qua đêm.

+ Vortex cho đều, sau đ ly tâm 14.000 vòng/phút trong 3 phút.

Bước 2: Đổ gel

+ Đổ gel theo cơng thức đƣợc trình bày nhƣ ảng 2.2

Bảng 2.2 Công thức pha dung dịch tạo một gel

Bước 3: Tiến hành điện di

+ ơm 10 μl dung dịch ly trích protein vào mỗi giếng của gel. + Cho 1 giọt chất chỉ thị màu Bromophenol vào mỗi gel.

+ Chỉnh đến 20 V đối với gel cô mẫu và 60 V đối với gel phân tách. + Ngừng điện di khi chất chỉ thị cách đáy gel từ 0,5-1 cm.

Bước 4: Nhuộm và rửa gel

+ Gel đƣợc nhuộm bằng dung dịch Cooomassie Brilliant Blue R-250 0,2%, l c nhẹ trong 30-45 phút.

+ Loại bỏ thuốc nhuộm. + Rửa gel bằng Autowave.

Hóa chất (1 gel) 12 % gel phân tách (ml) 5 % gel cô mẫu (ml)

Nƣớc cất 1,6 0,68 30 % Acrylamide 2 0,17 1,5 M Tris H (pH = 8,8) 1,3 - 1 M Tris HCl ( pH = 6,8) - 0,13 10% SDS 0,1 0,04 10% Amonium persulfate 0,05 0,01 TEMED 0,002 0,001

Bước 5: Đọc kết quả và bảo quản gel

2.3.4 Phƣơng pháp phân tích phẩm chất hạt

 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein

Tiến hành theo phƣơng pháp Lowry et al., (1951).

Bước 1: Chuẩn bị dung dịch trích

+ Dung dịch NaOH 0,1 N.

+ Dung dịch A (Na2CO3 2% + Na-K-tatrate 0,05% + NaOH 0,1N). + Dung dịch B (CuSO4 0,1%).

+ Dung dịch C (A:B = 45 :5). + Dung dịch Folin 1 N

Bước 2: Chuẩn bị mẫu

+ Cân 10 mg bột gạo + 1 ml NaOH 0,1 N. + L c ít nhất 2 giờ hay để qua đêm.

Bước 3: Pha loãng mẫu và đo

+ Ly tâm mẫu 14.000 vòng/phút trong 3 phút.

+ Hút 50 μl mẫu + 5 ml dung dịch C. Đối với mẫu blank, thay dung dịch ly trích bằng 50 μl NaOH 0,1 N.

+ Trộn đều và để yên trong 10 phút.

+ Thêm 50 μl Folin 1 N, trộn đều và để yên trong 30 phút.

+ L c đều mẫu, sau đ cho vào cuvette và đo ở bƣớc sóng 580 nm.

Bước 4: Dựng đƣờng chuẩn và tính kết quả

+ Pha dung dịch gốc Bovine serum albumin (BSA). + Đƣờng chuẩn có dạng:

Y = aX + b

Trong đ : Y Độ hấp thụ OD.

X: Lƣợng protein có trong mẫu đem đo. Hàm lƣợng protein đƣợc tính theo cơng thức:

Công thức: 100

100 %P  X 

 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng amylose

Tiến hành theo phƣơng pháp Cagampang and Rodriguez (1980).

Bước 1: Chuẩn bị dung dịch

+ Ethanol 95%. + HCl 30%. + NaOH 1N.

+ Dung dịch Iod (0,2% I2 và 2% KI).

Bước 2: Chuẩn bị mẫu

+ Cân 50 mg bột gạo đã đƣợc nghiền mịn, cho vào ống 50 ml. + Thêm 0,5 ml ethanol 95%, l c nhẹ cho tan đều.

+ Thêm 9,5 ml NaOH 1N. Đun sôi trong 10 phút và l c đều. + Để qua đêm ở nhiệt độ phòng.

Bước 3: Pha lỗng và đo mẫu

+ Rút 100 μl dịch trích cho vào bình định mức 25 ml (đối với mẫu thử thay dịch trích bằng 100 μl NaOH 1 N).

+ Thêm nƣớc cất khoảng ½ bình, l c đều. + Thêm 250 μl HCl 30 , l c đều.

+ Thêm 250 μl dung dịch Iod, l c đều. + Thêm nƣớc cất đến vạch định mức.

+ Chuyển sang ống 50 ml, l c đều và để yên trong 30 phút.

+ L c đều trƣớc khi cho vào cuvette. Đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 580 nm.

Bước 4: Dựng đƣờng chuẩn và tính kết quả

+ Đƣờng chuẩn có dạng: Y = aX + b

Trong đ Y: Độ hấp thụ OD

X: Lƣợng amylose có trong mẫu đem đo (mg/ml). + Tính hàm lƣợng amylose theo cơng thức:

100 2

%Amylose  X 

+ Đánh giá hàm lƣợng amylose theo thang đánh giá của IRRI (1988) đƣợc trình bày nhƣ ở ảng 2.3

Bảng 2.3 Hệ thống đánh giá chuẩn hàm lƣợng amylose cho lúa (IRRI, 1988) Nhóm Hàm lƣợng amylose (%) Gạo nếp Dẻo 0-2 Gạo tẻ: Rất thấp Dẻo trung bình 3-9 Thấp Dẻo trung bình 10-19 Trung bình Cứng cơm 20-25 Cao Rất cứng cơm > 25  Phƣơng pháp xác định cấp độ trở hồ

Theo phƣơng pháp của IRRI (1979)

+ Chuẩn bị hai mẫu cho mỗi giống/dòng đƣợc thử. Mỗi mẫu lấy sáu hạt gạo, cạo sạch lớp cám, chọn hạt không bị nứt, để vào dĩa petri.

+ Thêm 10 ml KOH 1,7% vào mỗi dĩa.

+ Đậy dĩa petri, để yên khoảng 23 giờ ở nhiệt độ phòng.

+ Đánh giá độ lan rộng và độ trong suốt của hạt gạo theo thang điểm của IRRI (1986), đƣợc trình bày ở Bảng 2.4.

Bảng 2.4 Bảng phân cấp độ độ trở hồ (IRRI, 1979)

Cấp trung bình sẽ đƣợc tính theo cơng thức:

Cấp trở hồ = N n Xi   Trong đ : xi : cấp độ trở hồ n: số hạt c cấp độ trở hồ xi N : số hạt thử nghiệm

Cấp độ trở hồ đƣợc đánh giá theo thang điểm của IRRI (1979) (Bảng 2.5)

Bảng 2.5 Đánh giá độ trở hồ theo thang điểm của IRRI (1979) Cấp Độ trở hồ 1-3 Cao 4-5 Trung bình 6-7 Thấp Cấp Độ lan rộng 1 Hạt gạo còn nguyên. 2 Hạt gạo phòng lên.

3 Hạt gạo phòng lên, viền còn nguyên hay r nét. 4 Hạt gạo phòng lên, viền còn nguyên và nở rộng. 5 Hạt rã ra, viền hoàn toàn nở rộng.

6 Hạt tan ra hòa chung với viền.

 Phƣơng pháp xác định độ bền thể gel

Theo phƣơng pháp của Tang et al. (1991).

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

+ Tách vỏ trấu và đo ẩm độ hạt gạo.

+ Nghiền mịn và cân mẫu (100 mg với ẩm độ 12%).

Bước 2: Hoàn tan mẫu

+ Thêm 0,2 ml ethanol 95% có chứa 0,025% thymol blue. + Thêm 2 ml KOH 0,2 N. Sau đ khuấy đều bằng máy Vortex. + Đậy n p kỹ và đun trong nồi cách thủy (nhiệt độ là 1000

C) khoảng 5 phút. + Lấy ra, để yên trong 5 phút và sau đ làm lạnh trong nồi nƣớc đá 10 phút.

Bước 3: Đọc và ghi kết quả

+ Để ống nghiệm nằm ngang trên bề mặt bằng phẳng, để gel chảy từ từ, sau một giờ tiến hành đo chiều dài thể gel (từ đáy đến mí trên của thể gel). + Đánh giá độ bền thể gel theo thang điểm của IRRI (1996) nhƣ đƣợc trình bày ở Bảng 2.5

Bảng 2.6 Phân cấp độ bền thể gel theo thang đánh giá của IRRI (1996) Cấp Chiều dài thể gel (mm) Loại độ bền thể gel

1 80 - 100 Rất mềm

3 61 - 80 Mềm

5 41 - 60 Trung bình

7 35 - 40 Cứng

9 < 35 Rất cứng

 Phƣơng pháp phân loại chiều dài và hình dạng hạt gạo (Khush and Paul, 1979)

Để đo chiều dài hạt gạo dùng giấy kẻ li đo nhiều lần. Mỗi dòng lấy 10 hạt gạo.

Bảng 2.7 Phân loại chiều dài và hình dạng hạt gạo (Khush and Paul, 1979)

 Phƣơng trắc nghiệm tính thơm bằng KOH 1,7% (Cải tiến giống lúa, 1979)

Bước 1: chuẩn bị mẫu

+ Lấy khoảng 23-34 hạt gạo cho vào ống nghiệm 15ml.

+ ơm vào mỗi ống nghiệm 5 ml dung dịch KOH 1,7 , đậy kín ống nghiệm bằng giấy bạc.

Bước 2: Sấy và ngửi mùi

+ Mang ống nghiệm sấy ở 50 độ C trong 30 phút.

+ Sau đ đem ra ngửi mùi (5 ngƣời ngửi ở hai mức độ thơm và khơng thơm, tính trung bình).

+ So sánh kết quả và cho kết luận sau cùng. 2.3.5 Phƣơng pháp thử rầy

ố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, có 13 nghiệm thức (9 dòng của THL01, Nàng Nhen, NK2 x Nhật 1, giống chuẩn nhiễm TN1, BN2 chuẩn kháng rầy cấp 1). Giống BN2 là hai giống c năng suất cao và đƣợc đánh giá là kháng rầy cấp 1 trong điều kiện ngoài đồng đƣợc sử dụng để nhằm đánh giá sơ bộ phản ứng ngoài đồng của các dòng lai chọn đƣợc.

Cách tiến hành

+ Nuôi rầy

Rầy nâu đựợc nuôi trên lô lúa 30 ngày tuổi. Giống lúa đƣợc dùng để nuôi rầy là Jasmine 85. Lô dùng nuôi rầy c chiều dài 1 m, rộng 1 m. Mỗi lô trồng 20-25 buội lúa. Những lô lúa này đƣợc đặt trong nhà lƣới và đƣợc bao quanh bởi lƣới kín, bên trong lơ c chứa đất và một lớp nƣớc khoảng 2-3 cm nhằm tạo ẩm độ cho rầy

Kích thƣớc Chiều dài (mm) Cấp Hình dạng hạt Tỷ lệ dài/rộng Cấp

Rất dài > 7,5 1 Thon dài > 3,0 1 Dài 6,61-7,5 3 Trung bình 2,1-3,0 3 Trung bình 5,51-6,6 5 ầu 1,1-2,0 5 Ng n < 5,5 7 Tròn < 1,0 7

phát triển. Trƣớc khi thả rầy vào, làm sạch gốc lúa, tỉa bỏ những bẹ lá già, bẹ gần sát mặt nƣớc, đảm bảo những bẹ mang trứng không rơi xuống nƣớc.

Sau khi chuẩn bị lô nuôi rầy, tiến hành b t rầy cái c bụng to thả vào. Số lƣợng rầy cái thả vào tùy thuộc vào lƣợng giống dùng tr c nghiệm và mật độ thả vào. Thông thƣờng một rầy cái cánh ng n c thể đẻ 300-400 trứng, rầy cái cánh dài c thể đẻ 100 trứng.

+ Chuẩn bị lúa tr c nghiệm

Hai ngày sau khi thả rầy, tiến hành gieo giống lúa tr c nghiệm (đã đƣợc ngâm 24 giờ, ủ 48 giờ trƣớc đ ) vào rổ nhựa 30 x 25 cm, c chứa sẵn một lớp đất dày 5 cm. Gieo ngẫu nhiên mỗi giống một hàng (Hình 2.3). Sau khi gieo tiến hành châm nƣớc cho khay nhựa, một lớp nƣớc mỏng 2-3 cm để ngăn ngừa kiến và tạo ẩm độ cho lúa phát triển. Một tuần sau khi gieo tỉa bỏ mỗi hàng chừa 15 cây.

Hình 2.4 Thử rầy

A: Lúa trắc nghiệm tính kháng rầy lúc 7 ngày tuổi B: Tủ để nuôi và thử rầy

+ Thả rầy: Khi lúa ở các nghiệm thức đƣợc 2-3 lá thật (5-7 ngày tuổi), tiến hành b t rầy tuổi 1-2 thả vào, mật số 5-8 con/cây. Rầy đƣợc thả vào bằng cách c t ngang cây lúa sau đ g nhẹ.

Thu thập chỉ tiêu

Khi thấy giống lúa chuẩn nhiễm TN1 chết 95% (hoặc một trong những giống tr c nghiệm chết trên 95% không nhất thiết phải là giống chuẩn nhiễm). Khả năng