CHƢƠNG 2 : PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.3 PHƢƠNG PHÁP
2.3.4 Phƣơng pháp phân tích phẩm chất hạt gạo
Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein
Tiến hành theo phƣơng pháp Lowry et al., (1951).
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch trích
+ Dung dịch NaOH 0,1 N.
+ Dung dịch A (Na2CO3 2% + Na-K-tatrate 0,05% + NaOH 0,1N). + Dung dịch B (CuSO4 0,1%).
+ Dung dịch C (A:B = 45 :5). + Dung dịch Folin 1 N
Bước 2: Chuẩn bị mẫu
+ Cân 10 mg bột gạo + 1 ml NaOH 0,1 N. + L c ít nhất 2 giờ hay để qua đêm.
Bước 3: Pha loãng mẫu và đo
+ Ly tâm mẫu 14.000 vòng/phút trong 3 phút.
+ Hút 50 μl mẫu + 5 ml dung dịch C. Đối với mẫu blank, thay dung dịch ly trích bằng 50 μl NaOH 0,1 N.
+ Trộn đều và để yên trong 10 phút.
+ Thêm 50 μl Folin 1 N, trộn đều và để yên trong 30 phút.
+ L c đều mẫu, sau đ cho vào cuvette và đo ở bƣớc sóng 580 nm.
Bước 4: Dựng đƣờng chuẩn và tính kết quả
+ Pha dung dịch gốc Bovine serum albumin (BSA). + Đƣờng chuẩn có dạng:
Y = aX + b
Trong đ : Y Độ hấp thụ OD.
X: Lƣợng protein có trong mẫu đem đo. Hàm lƣợng protein đƣợc tính theo cơng thức:
Công thức: 100
100 %P X
23
Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng amylose
Tiến hành theo phƣơng pháp Cagampang and Rodriguez (1980).
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch
+ Ethanol 95%. + HCl 30%. + NaOH 1N.
+ Dung dịch Iod (0,2% I2 và 2% KI).
Bước 2: Chuẩn bị mẫu
+ Cân 50 mg bột gạo đã đƣợc nghiền mịn, cho vào ống 50 ml. + Thêm 0,5 ml ethanol 95%, l c nhẹ cho tan đều.
+ Thêm 9,5 ml NaOH 1N. Đun sôi trong 10 phút và l c đều. + Để qua đêm ở nhiệt độ phịng.
Bước 3: Pha lỗng và đo mẫu
+ Rút 100 μl dịch trích cho vào bình định mức 25 ml (đối với mẫu thử thay dịch trích bằng 100 μl NaOH 1 N).
+ Thêm nƣớc cất khoảng ½ bình, l c đều. + Thêm 250 μl HCl 30 , l c đều.
+ Thêm 250 μl dung dịch Iod, l c đều. + Thêm nƣớc cất đến vạch định mức.
+ Chuyển sang ống 50 ml, l c đều và để yên trong 30 phút.
+ L c đều trƣớc khi cho vào cuvette. Đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 580 nm.
Bước 4: Dựng đƣờng chuẩn và tính kết quả
+ Đƣờng chuẩn có dạng: Y = aX + b
Trong đ Y: Độ hấp thụ OD
X: Lƣợng amylose có trong mẫu đem đo (mg/ml). + Tính hàm lƣợng amylose theo cơng thức:
100 2
%Amylose X
+ Đánh giá hàm lƣợng amylose theo thang đánh giá của IRRI (1988) đƣợc trình bày nhƣ ở ảng 2.3
24
Bảng 2.3 Hệ thống đánh giá chuẩn hàm lƣợng amylose cho lúa (IRRI, 1988) Nhóm Hàm lƣợng amylose (%) Gạo nếp Dẻo 0-2 Gạo tẻ: Rất thấp Dẻo trung bình 3-9 Thấp Dẻo trung bình 10-19 Trung bình Cứng cơm 20-25 Cao Rất cứng cơm > 25 Phƣơng pháp xác định cấp độ trở hồ
Theo phƣơng pháp của IRRI (1979)
+ Chuẩn bị hai mẫu cho mỗi giống/dòng đƣợc thử. Mỗi mẫu lấy sáu hạt gạo, cạo sạch lớp cám, chọn hạt không bị nứt, để vào dĩa petri.
+ Thêm 10 ml KOH 1,7% vào mỗi dĩa.
+ Đậy dĩa petri, để yên khoảng 23 giờ ở nhiệt độ phòng.
+ Đánh giá độ lan rộng và độ trong suốt của hạt gạo theo thang điểm của IRRI (1986), đƣợc trình bày ở Bảng 2.4.
25
Bảng 2.4 Bảng phân cấp độ độ trở hồ (IRRI, 1979)
Cấp trung bình sẽ đƣợc tính theo cơng thức:
Cấp trở hồ = N n Xi Trong đ : xi : cấp độ trở hồ n: số hạt c cấp độ trở hồ xi N : số hạt thử nghiệm
Cấp độ trở hồ đƣợc đánh giá theo thang điểm của IRRI (1979) (Bảng 2.5)
Bảng 2.5 Đánh giá độ trở hồ theo thang điểm của IRRI (1979) Cấp Độ trở hồ 1-3 Cao 4-5 Trung bình 6-7 Thấp Cấp Độ lan rộng 1 Hạt gạo còn nguyên. 2 Hạt gạo phòng lên.
3 Hạt gạo phòng lên, viền còn nguyên hay r nét. 4 Hạt gạo phòng lên, viền còn nguyên và nở rộng. 5 Hạt rã ra, viền hoàn toàn nở rộng.
6 Hạt tan ra hòa chung với viền.
26
Phƣơng pháp xác định độ bền thể gel
Theo phƣơng pháp của Tang et al. (1991).
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
+ Tách vỏ trấu và đo ẩm độ hạt gạo.
+ Nghiền mịn và cân mẫu (100 mg với ẩm độ 12%).
Bước 2: Hoàn tan mẫu
+ Thêm 0,2 ml ethanol 95% có chứa 0,025% thymol blue. + Thêm 2 ml KOH 0,2 N. Sau đ khuấy đều bằng máy Vortex. + Đậy n p kỹ và đun trong nồi cách thủy (nhiệt độ là 1000
C) khoảng 5 phút. + Lấy ra, để yên trong 5 phút và sau đ làm lạnh trong nồi nƣớc đá 10 phút.
Bước 3: Đọc và ghi kết quả
+ Để ống nghiệm nằm ngang trên bề mặt bằng phẳng, để gel chảy từ từ, sau một giờ tiến hành đo chiều dài thể gel (từ đáy đến mí trên của thể gel). + Đánh giá độ bền thể gel theo thang điểm của IRRI (1996) nhƣ đƣợc trình bày ở Bảng 2.5
Bảng 2.6 Phân cấp độ bền thể gel theo thang đánh giá của IRRI (1996) Cấp Chiều dài thể gel (mm) Loại độ bền thể gel
1 80 - 100 Rất mềm
3 61 - 80 Mềm
5 41 - 60 Trung bình
7 35 - 40 Cứng
9 < 35 Rất cứng
Phƣơng pháp phân loại chiều dài và hình dạng hạt gạo (Khush and Paul, 1979)
Để đo chiều dài hạt gạo dùng giấy kẻ li đo nhiều lần. Mỗi dòng lấy 10 hạt gạo.
27
Bảng 2.7 Phân loại chiều dài và hình dạng hạt gạo (Khush and Paul, 1979)
Phƣơng trắc nghiệm tính thơm bằng KOH 1,7% (Cải tiến giống lúa, 1979)
Bước 1: chuẩn bị mẫu
+ Lấy khoảng 23-34 hạt gạo cho vào ống nghiệm 15ml.
+ ơm vào mỗi ống nghiệm 5 ml dung dịch KOH 1,7 , đậy kín ống nghiệm bằng giấy bạc.
Bước 2: Sấy và ngửi mùi
+ Mang ống nghiệm sấy ở 50 độ C trong 30 phút.
+ Sau đ đem ra ngửi mùi (5 ngƣời ngửi ở hai mức độ thơm và không thơm, tính trung bình).
+ So sánh kết quả và cho kết luận sau cùng. 2.3.5 Phƣơng pháp thử rầy
ố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, có 13 nghiệm thức (9 dòng của THL01, Nàng Nhen, NK2 x Nhật 1, giống chuẩn nhiễm TN1, BN2 chuẩn kháng rầy cấp 1). Giống BN2 là hai giống c năng suất cao và đƣợc đánh giá là kháng rầy cấp 1 trong điều kiện ngoài đồng đƣợc sử dụng để nhằm đánh giá sơ bộ phản ứng ngoài đồng của các dòng lai chọn đƣợc.
Cách tiến hành
+ Nuôi rầy
Rầy nâu đựợc nuôi trên lô lúa 30 ngày tuổi. Giống lúa đƣợc dùng để nuôi rầy là Jasmine 85. Lô dùng nuôi rầy c chiều dài 1 m, rộng 1 m. Mỗi lô trồng 20-25 buội lúa. Những lô lúa này đƣợc đặt trong nhà lƣới và đƣợc bao quanh bởi lƣới kín, bên trong lơ c chứa đất và một lớp nƣớc khoảng 2-3 cm nhằm tạo ẩm độ cho rầy
Kích thƣớc Chiều dài (mm) Cấp Hình dạng hạt Tỷ lệ dài/rộng Cấp
Rất dài > 7,5 1 Thon dài > 3,0 1 Dài 6,61-7,5 3 Trung bình 2,1-3,0 3 Trung bình 5,51-6,6 5 ầu 1,1-2,0 5 Ng n < 5,5 7 Tròn < 1,0 7
28
phát triển. Trƣớc khi thả rầy vào, làm sạch gốc lúa, tỉa bỏ những bẹ lá già, bẹ gần sát mặt nƣớc, đảm bảo những bẹ mang trứng không rơi xuống nƣớc.
Sau khi chuẩn bị lô nuôi rầy, tiến hành b t rầy cái c bụng to thả vào. Số lƣợng rầy cái thả vào tùy thuộc vào lƣợng giống dùng tr c nghiệm và mật độ thả vào. Thông thƣờng một rầy cái cánh ng n c thể đẻ 300-400 trứng, rầy cái cánh dài c thể đẻ 100 trứng.
+ Chuẩn bị lúa tr c nghiệm
Hai ngày sau khi thả rầy, tiến hành gieo giống lúa tr c nghiệm (đã đƣợc ngâm 24 giờ, ủ 48 giờ trƣớc đ ) vào rổ nhựa 30 x 25 cm, c chứa sẵn một lớp đất dày 5 cm. Gieo ngẫu nhiên mỗi giống một hàng (Hình 2.3). Sau khi gieo tiến hành châm nƣớc cho khay nhựa, một lớp nƣớc mỏng 2-3 cm để ngăn ngừa kiến và tạo ẩm độ cho lúa phát triển. Một tuần sau khi gieo tỉa bỏ mỗi hàng chừa 15 cây.
Hình 2.4 Thử rầy
A: Lúa trắc nghiệm tính kháng rầy lúc 7 ngày tuổi B: Tủ để nuôi và thử rầy
+ Thả rầy: Khi lúa ở các nghiệm thức đƣợc 2-3 lá thật (5-7 ngày tuổi), tiến hành b t rầy tuổi 1-2 thả vào, mật số 5-8 con/cây. Rầy đƣợc thả vào bằng cách c t ngang cây lúa sau đ g nhẹ.
Thu thập chỉ tiêu
Khi thấy giống lúa chuẩn nhiễm TN1 chết 95% (hoặc một trong những giống tr c nghiệm chết trên 95% không nhất thiết phải là giống chuẩn nhiễm). Khả năng kháng rầy đƣợc đánh giá theo tiêu chuẩn đánh giá quốc tế (Standard Evaluation System for Rice, 1980).
29
Bảng 2.8 Bảng đánh giá khả năng kháng rầy theo chuẩn quốc tế (1980)
Cấp bệnh Đánh giá iểu hiện 0 Rất kháng Không thiệt hại 1 Kháng Thiệt hại nhẹ
3 Hơi kháng Lá thứ nhất và lá thứ 2 của cây hầu hết bị vàng 1 phần 5 Hơi nhiễm Cây vàng, phân nữa số cây chết hoặc héo
7 Nhiễm Hơn một nửa số cây bị còn lại còi cọc nặng 9 Rất nhiễm Tất cả cây bị chết
2.4 PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel.
Sử dụng phần mềm thống kê SPSS để phân tích phƣơng sai NOV và so sánh Ducan.
30
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ THẢO LUẬN
3.1 KẾT QUẢ LAI TẠO
Kết quả lai tạo thu đƣợc 18 hạt.
Do Nàng Nhen thuộc nh m lúa mùa, kích thƣớc hạt lúa nhỏ, hạt phát triển đƣợc giới hạn bởi vỏ lúa, trong quá trình khử đực và thụ phấn c thể ảnh hƣởng đến nƣớm nhụy cái nên sau khi thụ phấn từ cây cha (NK2 x Nhật 1) hạt phát triển khơng bình thƣờng (Hình 3.1).
Hình 3.1 Hạt lai từ tổ hợp Nàng Nhen x (NK2 x Nhật 1)
3.2 THẾ HỆ F1
Các cá thể thế hệ F1 và cây cha mẹ đƣợc trồng riêng biệt từng chậu vào cùng thời gian, để thuận tiện cho việc theo d i, so sánh chỉ tiêu nông học và thành phần năng suất. Tuy hạt F1 khá nhiều nhƣng trong quá trình trồng và chăm s c do ảnh hƣởng của thời tiết, sâu bệnh….nên chỉ thu chọn đƣợc 5 cá thể đạt đƣợc chỉ tiêu mong muốn và tất cả các cá thể thế hệ F1 đƣợc quy ƣớc là THL 07.
31
Một số chỉ tiêu nông học và thành phần năng suất của cây F1 Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu nông học cây F1
Nghiệm thức TGST (ngày) Cao cây (cm) Số bông /bụi Dài bông (cm)
124 179 7 25,9 124 146 6 26,2 124 168 8 27,9 114 148 10 26,4 114 160 9 26,9 TBF1 120 160 8 26,7 Nàng Nhen 120-140 152 6 22,5 NK2 x Nhật 1 90-95 130 22 24,9 TBp 105-118 141 14 23,7
THL: Tổ hợp lai, 07: Thế hệ F1, TGST: Thời gian sinh trưởng
TBF1: Trung bình các cá thể F1, TBp: Trung bình cây cha mẹ
Thời gian sinh trƣởng
Thời gian sinh trƣởng là một đặc tính của giống nhƣng chịu ảnh hƣởng phần nào bởi điều kiện thời tiết, mùa vụ, chế độ nƣớc, liều lƣợng phân b n (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008).
Qua kết quả ảng 3.1 thời gian sinh trƣởng trung bình của các tổ hợp lai là 120 ngày, dài hơn thời gian sinh trƣởng của cây cha (90-95 ngày) nhƣng thấp hơn thời gian sinh trƣởng của cây mẹ (120-140 ngày). Từ đ , cho thấy các tổ hợp lai c thời gian sinh trƣởng nghiêng về cây mẹ (Nàng Nhen). Nhƣ vậy, theo Nguyễn Thành Hối (2007), thì thời gian sinh trƣởng trung bình của các tổ hợp lai trên đƣợc xếp vào nh m (lúa trung mùa, c TGST 120-140 ngày).
Chiều cao cây
Theo Nguyễn Ngọc Đệ (2008), cho rằng chiều cao cây là đặc điểm thực vật quan trọng nhất liên quan đến sự đổ ngã và g p phần làm tăng năng suất lúa. ên cạnh đ , theo Clarkson and Hanson (1980), thân cây lúa dày hơn thì c nhiều b mạch, n sẽ cung cấp và tạo khả năng vận chuyển tích lũy chất khơ tốt hơn, thân
32
cứng và dày c ý nghĩa quan trọng trong việc chống đỗ ngã và dẫn tới chỉ số thu hoạch cao.
Theo Jennings et al., (1979), thân rạ thấp và cứng quyết định tính kháng đổ ngã của cây lúa. Qua kết quả ảng 3.1 cho thấy chiều cao cây trung bình của các THL (160,2 cm) cao hơn trung bình chiều cao cây của cha và mẹ (141 cm). Căn cứ vào nhận định trên thì các dịng lúa đƣợc chọn vẫn chƣa đạt đƣợc yêu cầu về chiều cao cây, ảnh hƣởng đến năng suất và c thể đƣợc giải thích một phần do điều kiện môi trƣờng và một phần do hiện tƣợng ƣu thế lai.
Số bông trên bụi
Số bông c thể đ ng g p 74 năng suất, trong khi đ số hạt và trọng lƣợng hạt chỉ c thể đ ng g p khoảng 26 (nguyễn Đình Giao và ctv., 1997). Từ kết quả ảng 3.1 cho thấy số bơng trên bụi trung bình của các dịng đƣợc chọn là 8 bông cao hơn số bông trên bụi của Nàng Nhen (6 bông) nhƣng thấp hơn NK2 x Nhật 1 (22 bông). Từ đ , cá thể F1 mang đặc tính tốt của cây cha, đồng thời cải thiện đƣợc số bông trên bụi của cây mẹ g p phần gia tăng năng suất.
Chiều dài bông
Chiều dài bông thay đổi tùy theo giống và g p phần gia tăng năng suất, bông lúa đ ng vai trò quan trọng trong quang hợp, quang hợp c thể gia tăng 25-40% nếu độ cao của cây lúa trong quần thể thấp hơn 40 chiều cao của tán lá (Đặng Nguyệt Quế, 2011). Từ kết quả ảng 3.1 chiều dài bơng trung bình của các cá thể là 26,7 cm và cao hơn trung bình chiều dài bơng của cây cha mẹ (23,7 cm). Điều này thể hiện ƣu thế lai của các tổ hợp lai thế hệ F1 và c ý nghĩa rất quan trọng trong công tác chọn giống.
Hạt chắc trên bông và tỷ lệ hạt chắc
Số hạt ch c trên bông đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu nhằm cải thiện tính trạng này để tăng năng suất. Theo Nguyễn Ngọc Đệ (1998), lúa sạ c trung bình từ 80-100 hạt trên bông, lúa cấy c số hạt trên bông cao hơn lúa sạ từ 100-120 hạt trên bông là tốt trong điều kiện Đồng bằng sông Cửu Long. Qua kết quả bảng 3.2 cho thấy, trung bình số hạt tr c trên bơng của các thể F1 là 119 hạt nằm giữa số hạt ch c trên bông của cây mẹ (91 hạt) và cây cha (124 hạt). Vì vậy, thể hiện tiềm năng cho năng suất cao của các tổ hợp lai.
Tỷ lệ hạt ch c phụ thuộc vào số hoa trên bơng, đặc tính sinh lý của cây lúa và chịu ảnh hƣởng lớn của điều kiện ngoại cảnh (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008). Thƣờng số hoa trên bông quá nhiều sẽ dẫn đến tỷ lệ hạt ch c thấp. Nhƣng cũng qua ảng 3.2 ta
33
thấy phần trăm hạt ch c trung bình của các THL (35,6 ) thấp hơn cây cha (47,6 ) và mẹ (78 ), nên cần tiếp tục trồng và theo d i chỉ tiêu này. Qua những kết quả trên g p phần giải thích cho số hạt ch c trên bơng và tỷ lệ hạt ch c không c tƣơng quan nhƣng giống càng dài ngày thì tỷ lệ hạt ch c càng cao.
Trọng lƣợng 1.000 hạt
Theo Nguyễn Ngọc Đệ (2008), đã khẳng định, trọng lƣợng hạt đƣợc quyết định ngay từ thời kỳ phân h a địng cho đến khi lúa chín. Trọng lƣợng hạt tùy thuộc vào c hạt và độ mẩy (no đầy) của hạt. Qua kết quả ảng 3.2 trọng lƣợng trung bình 1.000 hạt (18,3 g) của các tổ hợp lai đều cao hơn so với trọng lƣợng 1.000 hạt của nàng Nhen (16,0 g) nhƣng thấp hơn NK2 x Nhật 1 (24,5 g). Vì thế, các cá thể này c khả năng gia tăng năng suất rất cao, cần tiếp tục đƣợc trồng và theo d i.
Bảng 3.2 Một số chỉ tiêu thành phần năng suất cây F1
Nghiệm thức Hạt chắc/bông % hạt chắc TL 1.000 hạt (g) 102 36,1 16,3 116 37,7 17,6 134 36,4 17,9 118 38,9 21,3 127 29,1 18,2 TBF1 119 35,6 18,3 Nàng Nhen 91 78,0 16,0 NK2 x Nhật 1 124 47,6 24,5 TBp 108 62,8 20,25 THL: Tổ hợp lai, 07: Thế hệ F1, TL: Trọng lượng
TBF1: Trung bình các cá thể thế hệ F1, TBp: Trung bình cây cha mẹ
3.3 THẾ HỆ F2
Sau khi chọn đƣợc cá thể ƣu tú, tiến hành chọn ngẫu nhiên 200 hạt thế hệ F1 đem nhân lên. Trong quá trình trồng và chăm s c ta chọn đƣợc 9 cá thể trong 15 cá thể c độ cứng cây cao nhất, thời gian sinh trƣởng tƣơng đối ng n, ít sâu bệnh và