Môi trường MS(Murashige&Skoog),gồm các thành phần sau * Nguyên tố đa lượng
- NH4NO3 1650 mg/l - KNO3 1900 mg/l - MgSO4.7H2O 370 mg/l - Ca(NO3).4H2O 400 mg/l - KH2PO4 170 mg/l * Nguyên tố vi lượng - H3BO4 6,3 mg/l - ZnSO4.7H2O 8,6 mg/l - MnSO4.4H2O 22,3 mg/l - KI 0,83 mg/l - Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/l - CuSO4.5H2O 0,025 mg/l - CoCl2.6H2O 0,025 mg/l * Vitamine - Pyridoxine(B6) 1mg/l - Thiamine (B1) 1mg/l - Nicotinic acid 1mg/l - m-Inositol 100 mg/l - Biotine 0,01mg/l - D-Pantothnic acid 1mg/l * Fe EDTA - FeSO4.7H2O 27,8 mg/l - Na2EDTA.2H2O 37,3 mg/l 2.2.2. Nguyên vật liệu
- Điều kiên nuôi cấy
Môi trường Murashige và Skoog (M+S). Môi trường Knudson C.
* Ph: 5,8.
* Ánh sáng 5.O00 lm/m2 *Quang kỳ 14 giờ
* Nhiệt độ 110 0C
2.2.3. Khử trùng mẫu
*Rửa sạch chồi Mokara dưới vòi nước chảy.Dùng dao mổ lột sạch các lá non bao quanh chồi cho đến khi để lộ chồi ngọn
* Dùng gòn lau nhẹ lên thân chồi, ngâm chồi trong xà bông loãng trong 10 phút, rửa cho sạch xà phòng dưới vòi nước chảy.
* Trong tủ cấy, ngâm chồi vào cồn 70 độ trong 1 phút, sau đó cho chồi vào becher có chứa dung dịch javel có nồng độ (1 thể tích javel: 4 thể tích nước cất vô trùng) trong 10 phút, lắc đều tay.
* Dùng kẹp vô trùng cho chồi vừa được khử trùng vào becher vô trùng, rửa các chồi này bằng nước cất vô trùng cho sạch javel (rửa 3 lần).
* Cắt bỏ các mô chết phần gốc chồi, tách bỏ các lá bên bằng kim mũi nhọn để có được một đỉnh chồi mang 4 – 5 tiền phát khởi lá, cấy từng chồi vào ống nghiệm có chứa môi trường. Dùng viết aceton ghi rõ tên giống , ngày cấy, tên môi trường nuôi cấy.
* Đặt tất cả vào phòng nuôi và quan sát.
2.2.4. Khởi tạo PLB từ mô lá
Các mẫu lá thu được từ các chồi sinh dưỡng được cắt theo kích thước 5 x 5 mm. Các mẫu lá được đặt nuôi trên môi trường MS 1/2 bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng thực vật NAA 1mg/l, BA 10 mg/l, Adenin 10 mg/l
Sau 10 tuần nuôi cấy:
Các PLB được hình thành chủ yếu từ các mảnh lá ở phần gốc và ít ở các mảnh lá phần đỉnh. Lá và thân mặc dù có những nét giống nhau về hình thái giải phẫu nhưng khác nhau về cách sinh trưởng và cách sắp xếp các mô. Lá có sinh trưởng tận cùng hữu hạn. Do đó, để có sự phát sinh hình thái mới, đỉnh lá cũng cần phải có sự phân hoá của các tế bào nhu mô để trở về trạng thái mô phân sinh.
Sau một thời gian, các chồi xuất hiện xung quanh mép lá (nơi có vết thương) tiếp tục phát triển trong khi phần mô lá ban đầu bị hoại đi. Phiến lá ban đầu được sử dụng như nguồn dinh dưỡng khởi đầu cho PLB và cho chồi sau này nhưng hệ thống mạch của chồi được hình thành thì hoàn toàn độc lập với hệ thống mạch của mô mẹ.
2.2.5. Sự tái sinh chồi từ PLB
Hình 2.1. Sự hình thành chồi từ hoa Mokara
Theo nhiều tác giả khi tái sinh thành cây con từ PLB chỉ cần sử dụng các môi trường khoáng có bổ sung nước dừa, peptone, khoai tây…mà không sử dụng bất kỳ chất điều hòa tăng trưởng nào. Tanaka và Sakanishi (1985) và Tanaka (1987) đã sử dụng môi trường Knudson C cải tiến, môi trường Hyponex cải tiến, còn Haas-von Schmude (1983,1985) sử dụng môi trường MS trong việc tái sinh cây con từ PLB. Griesbach (1983) sử dụng môi trường Murashige và Skoog cho việc tái sinh cây con từ PLB, trong khi Lin (1986) sử dụng môi trường Knudson C cải tiến có bổ sung BA (1 mg/l) để chuyển PLB thành cây con
2.2.6. Sự ra rễ
Thông thường các chồi tái sinh từ PLB sẽ ra rễ và phát triển mạnh trên môi trường có bổ sung nước dừa, chuối, khoai tây… mà không cần bất kỳ chất điều hòa tăng trưởng nào hết. Tuy nhiên, việc này còn tùy thuộc vào giống. Có một ít giống rất dễ đẻ chồi nách làm chồi chính phân nhánh không phát triển rễ được, lá nhỏ, thân chồi kéo dài, vì vậy, chồi thường tồn tại ở dạng cụm chồi. Để khắc phục điều này, cấy từng chồi riêng lẻ lên môi trường có hormone tăng trưởng IBA với nồng độ 0.5-1 mg/l, chồi sẽ ra rễ dài, lá to. Sau 3-4 tháng nuôi cấy có thể đem cây con ra trồng ngoài ườn ươm.
2.2.7. Chuyển cây ra vườn ươm
Khi cây con cao khoảng 5-7 cm và có từ 3-4 lá thì lúc này ta có thể chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vô trùng có bổ sung các chất dinh dưỡng. Sau một thời gian cây phát triển ổn định ta đem chuyển vào chậu. Sau khi chuyển chậu khoảng một tuần mới được bón phân, lúc này cây đã có đủ sức chống chọi với bệnh tật.
Như vậy, từ một mô hoa Mokara được chọn nuôi cấy cho đến ra cây con có 3-4 lá ta chuyển ra vườn trồng mất thời gian khoảng từ 8 đến 11 tháng.
Như vậy toàn bộ qúa trình nhân giống trên ta được cây con mang đặc tính giống hoàn toàn với cây cha mẹ (cây con ổn định về mặt di truyền), cây con không nhiễm bệnh và tạo được một số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn. Tuy nhiên, việc cấy mô cần thực hiện theo đúng quy trình đã chọn ra tức là phải có điều kiện về trang thiết bị đầy đủ, môi trường nhân tạo thích hợp, đặc biệt là điều kiện vô trùng phải được đảm bảo nghiêm ngặt. Có như vậy ta mới đảm bảo hiệu quả từ khâu nuôi cấy trong phòng thí nghiệm đến trồng ngoài vườn ươm.
Sau khi trình bày một số phương pháp nhân nhanh hoa Mokara sạch bệnh bằng phương pháp in vitro, tôi thấy phương pháp sử dụng đỉnh sinh trưởng là phương pháp cho hiệu quả cao hơn so với những phương pháp khác. Phương pháp này có ưu điểm là tạo ra cây con sạch bệnh, khả năng nhân giống nhanh.Với đặc điểm là hoa cắt cành lại là hoa có hệ số nhân cao nên khi áp dụng nuôi cấy mô hoa Mokara chiếm ưu thế rất lớn cho quá trình sản xuất đáp ứng nhu cầu cho người Việt Nam và thế giới trong tương lai không xa.
Bên cạnh đó, ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô vào nhân nhanh invitro là tiến bộ kỹ thuật đặc biệt sẽ góp phần giải quyết vấn đề nguồn giống cho nước ta, tiết kiệm chi phí mua giống và nâng cao quy mô sản xuất hoa phong Lan từ quy mô nhỏ lẻ, hộ gia đình lên quy mô công nghiệp. Thành công của kỹ thuật nhân nhanh hoa Mokara in vitro còn tạo ý nghĩa thực tiễn to lớn cho xã hội.
Trong thời gian thực hiện đồ án chuyên môn này, tôi đã tiếp thu được một số kiến thức về ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô trong nhân giống cây trồng nói chung và hoa Mokara nói riêng. Tuy nhiên để hoàn thành được đồ án này tôi đã được sự tận tình giúp đỡ của cô Phạm Thị Kim Cúc, cô đã giúp tôi từng bước trong việc thu thập, tổng hợp tài liệu. Với sự chỉ dẫn nhiệt tình của cô tôi đã hoàn thành được đề tài: “ nhân nhanh invitro hoa
Mokara”
Cuối cùng tôi xin cảm ơn nhà trường và khoa công nghệ lương thực thực phẩm đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện đồ án này. Trong quá trình thực hiện đề tài sẽ không tránh khỏi thiếu sót và hạn chế về mặt kiến thức.Vì vậy, tôi mong các bạn cùng thầy cô sữa chữa, đóng góp ý kiến để tôi tiến bộ hơn trong những đề tài sau. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn .Chúc bạn đọc sức khỏe!
-TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1] Trần Văn Bảo ,1999.Kỹ thuật nuôi trồng phong lan,nhà xuất bản trẻ.Trang 5-74 [2] Nguyễn Văn Hiền, nghiên cứu thuốc trừ nấm cho loài hoa phong lan
[3] Trần Hợp ,1998,2000.Phong lam Việt Nam.Nhà xuất bản nông nghiêp TP HCM [4] Dương Công Kiên ,2003, Nuôi cấy mô thực vật II, NXB Đại học quốc gia TP. HCM [5] Bùi Văn Lệ - chủ biên, 2001, Thực tập Công nghệ sinh học thực vật, Trường ĐH Khoa học tự nhiên TP. HCM.
[6,9]Nguyễn Đức Lương và Lê Thị Thùy Tiên, 2002
[7] Trần Văn Minh ,1999, giáo trình công nghệ sinh học thực vật.Viện sinh học nhiệt đới
[8] CN-Huỳnh Thái Phụng, giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh.Trung tâm kỹ thuật và công nghệ sinh học Tiền Giang
[10] Nguyễn Bảo Toàn ,2004.giao trình nuôi cây mô và tế bào thực vật.Khoa nông nghiệp ,Trường đại học Cần Thơ, trang 7-51
[11] Anh Nguyễn Văn Trớ,Gia Lộc-Trảng Bàng –Tây Ninh.
[12] Dương Hoa Xô, GĐ Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM [13] http:/www.vnn.vn/nong thon.
[14] http:/www.hoaphonglan.org. [15] http:/www.rauhoaquavietnam.vn
-TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI
[16] Begum,2000
[17,19] Champagnat (1997) và Fast (1980)
[18] Debergh.PC.1991.Control of vitro plant propagation
[20] Edwin F. George (1993), Plant Propagation by Tissue Culture, part 1, Exegetics [21] Haberlandt 1902
[22] Morel, 1960 [23] Moxolov,1987 [24]Quack 1997