1.5.7.1. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô ( in vitro)
Từ một cây mẹ ban đầu có thể nhân ra hàng ngàn cây có kích thứơc và chất lượng đồng đều như nhau, giúp việc nhân giống được nhanh hơn. Nếu chọn lựa cây mẹ ban đầu tốt, như có đặc tính ra hoa liên tục.
* Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng hoa Mokara
*Tạo cây sạch virus [22,24]
Một trong những điều kiện cần thiết cho việc nhân giống là cây con phải sạch virus. Nhiều nghiên cứu cho rằng cứ cấy đỉnh sinh trưởng là thu được cây con sạch bệnh nhưng thực tế thì không hoàn toàn như vậy. Các nghiên cứu cho thấy chỉ khi nuôi cấy một đỉnh sinh trưởng 1mm với 2 tiền phát khởi lá mới thu được cây con sạch virus. Một số nguyên nhân giúp mô phân sinh ngọn không bị nhiễm virus là:
+ Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ thống mô dẫn mà hệ thống này không có ở mô phân sinh ngọn
+ Trong sự phân chia các tế bào mô phân sinh ngọn không cho phép sao chép các thông tin di truyền của virus
+ Hệ thống vô hiệu hóa virus ở vùng mô phân sinh ngọn mạnh hơn các vùng khác trong cây.
Nồng độ auxin cao ở đỉnh sinh trưởng có thể ngăn cản quá trình sao chép của virus. + Virus thường thấy nhất trên hoa lan là một chủng đặc biệt của virus khảm thuốc lá, được biết trước hết là virus đốm vòng Odontoglossum.
Nhiều cây bị xâm nhiễm bởi virus có triệu chứng kém phát triển, bị thối, xoăn lá, có sọc trên lá hoặc hoa, năng suất giảm và sau đó là cây chết. Ngoài ra bệnh virus còn là nguy cơ truyền bệnh cho cây khỏe những năm sau. Mặt khác, virus không thể tiêu diệt, phòng trừ như những bệnh vi khuẩn, nấm, mà chúng tiềm tàng, tích lũy dần dần trong cây và làm thoái hoá giống. Do đó cách duy nhất là loại bỏ virus ra khỏi cây bị bệnh.
* Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng [5,17,19,20]
Theo Champagnat (1997) và Fast (1980) Các chồi lan đang tăng trưởng dài 10-15 cm vừa mới nhú lá thường được dùng làm nguyên liệu cho việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Khi cấy đỉnh sinh trưởng chỉ có vùng xung quanh tiền phát khởi lá u lên và cuối cùng tạo thành protocorm. Còn đối với Cattleya khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường bị hóa nâu.
Vì lý do đó mà đỉnh sinh trưởng thường được cắt trong môi trường lỏng hoặc nước cất vô trùng và được nuôi trong môi trường không có agar, nhờ đó các chất nâu dễ khuyếch tán vào môi trường. Sự thành lập protocorm ở Mokara mất nhiều thời gian và luôn tạo ra ở phần gốc mẫu cấy. Các protocorm tạo thành được tách ra và cấy chuyền vào môi trường mới để thành lập các protocorm bất định từ các protocorm ban đầu, nếu không được cấy chuyền chúng sẽ phát triển thành chồi và ra rễ.
Môi trường nuôi cấy thường môi trường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tương đối đơn giản.Môi trường khoáng MS có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng BA 1mg/l và NAA 0.1 mg/l. Ngoài ra các chất chiết từ trái cây cũng được sử dụng như nước dừa 10%, khoai tây.Sau 10-12 tuần nuôi cấy, các đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục và tạo ra các khối tròn nhỏ gọi PLB (protocorm like body). Để có được số lượng lớn PLB làm nguồn mẫu để phục vụ sản xuất. Các PLB này được tách ra thành những cụm nhỏ và cấy sang môi trường kích thích nhân nhanh PLB, tuy nhiên chúng cũng dễ dàng tái sinh chồi ngay trên chính môi trường nhân nhanh. Để có cây con hoàn chỉnh cần tách các chồi riêng lẻ rồi cấy lên môi trường kích thích ra rễ, cây con có thể xuất vườn sau 4-5 tháng nuôi cấy.
1.5.7.2. Phương pháp nhân giống từ hom [12]
Đây là phương pháp nhân giống đơn giản bằng cách cây con được cắt thẳng từ đoạn trên cùng đọt của cây mẹ. Thông thường tùy theo yêu cầu quy cách hom giống tối thiểu phải bao gồm từ 2- 3 rễ đâm ra từ thân cây mẹ. Kích cỡ thường để trồng là tối thiểu 25 – 30 cm, có thể tới 50 – 60 cm. Hom càng dài thì khả năng cây càng khỏe do có nhiều rễ, sau khi cắt trồng sang vườn mới thì khả năng phục hồi nhanh, mau ra hoa trở lại. Tùy theo đặc tính
Hình 1.14. Sơ đồ cắt dọc đỉnh sinh trưởng chồi lan Mokara
giống, sau 3 tháng cây con cắt từ đọt đã có thể cho hoa nhưng thông thường để dưỡng cây người ta cắt bỏ các phát hoa ở giai đọan này.
Nhược điểm của phương pháp này là giống đợt đầu nhân ra với số lượng hạn chế, cứ một cây mẹ thì cắt được một đọt - tức 1 cây con. Tuy nhiên sau khi cắt đọt, cây mẹ nếu chăm sóc tốt từ các nách lá, tập trung phần trên gần chỗ cắt sẽ ra tiếp tục các mầm cây con. Thông thường từ cây mẹ sẽ ra được 2 - 3 chồi, tối đa có thể 4 chồi, sau khoảng 6 tháng cây con sẽ phát triển hoàn chỉnh và có thề tách ra để trồng. Giá thành cây giống cũng cao giống như cây mẹ.
1.5.7.3. Phương pháp nhân giống từ hom có cải tiến [12]
Biện pháp cắt hom lấy phần ngọn làm cây giống, còn phần gốc sẽ phát triển các chồi con thành cây thành phẩm để trồng đang được nhà vườn trồng lan cắt cành Mokara áp dụng rộng rãi. Tuy nhiên, một điểm hạn chế của phương pháp này là hệ số nhân chồi không cao. Từ một cây mẹ ban đầu, sau khi cắt hom, lấy phần ngọn ta được 01 cây thành phẩm thì số lượng chồi con sinh ra không nhiều, từ 2 – 3 chồi, tối đa có thể 4 chồi. Để cải thiện hệ số này, bằng cách áp dụng các biện pháp kỹ thuật để tác động vào để nâng cao khả năng ra chồi của các giống Mokara. Các lọai phân bón lá có hàm lượng đạm cao như 31-11-11 kết hợp lọai có chứa axit amin, rong biển được phun liên tục vào thời điểm trước khi cắt đọt 1 tháng và sau khi cắt 6 tháng.
Kết quả thu được cho thấy: đối với cả 2 giống thí nghiệm, tất cả các công thức có xử lý phân bón lá 31-11-11 kết hợp với rong biển, phân Terra Sorb ( có chứa acid amin ) đã cho số lượng chồi thu được cao hơn hẳn so với đối chứng từ 64 – 114%. Cũng như cao hơn so với công thức chỉ xử lý phun phân bón lá lọai 31-11-11. Số lượng chồi đạt tiêu chuẩn sau 6 tháng cắt đọt trong công thức này cũng cao hơn so với công thức đối chứng và công thức phun 31-11-11. Trong công thức có xử lý rong biển là lọai phân bón lá có chứa chất kích thích sinh trưởng Cytokinin. Đây là loại chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng kích thích sự phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là phân hóa chồi. Nếu tỷ lệ Auxin cao hơn Cytokinin thì kích thích ra rễ, còn tỷ lệ Cytokinin cao hơn Auxin thì kích thích sự phát triển của chồi nách, giải phóng cây khỏi sự kìm hãm của chồi ngọn. Ngòai ra, lọai phân bón có chứa acid amin cũng góp phần cho sự phát triển về chiều cao của các chồi nách sau khi đọt cây mẹ bị cắt.
Hình 1.15. Cây lan Mokara được xử lý ra chồi sau khi cắt đọt 3 tháng
PHẦN 2 KẾT QUẢ
2.1. Sơ đồ quy trình
2.2. Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị môi trường
Nguyên vật liệu
Khử trùng mẫu
Khởi tạo PLB từ mô lá
Sự tái sinh chồi từ mô lá
Sự ra rễ
Chuyển cây ra vườn ươm
Có nhiều phương pháp để nhân nhanh invitro hoa Mokara. Tuy nhiên tôi xin chọn một trong các cách sau để nhân nhanh đó là sử dụng đỉnh sinh trưởng từ hoa Mokara.
2.2.1. Chuẩn bị môi trường
Môi trường MS(Murashige&Skoog),gồm các thành phần sau * Nguyên tố đa lượng
- NH4NO3 1650 mg/l - KNO3 1900 mg/l - MgSO4.7H2O 370 mg/l - Ca(NO3).4H2O 400 mg/l - KH2PO4 170 mg/l * Nguyên tố vi lượng - H3BO4 6,3 mg/l - ZnSO4.7H2O 8,6 mg/l - MnSO4.4H2O 22,3 mg/l - KI 0,83 mg/l - Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/l - CuSO4.5H2O 0,025 mg/l - CoCl2.6H2O 0,025 mg/l * Vitamine - Pyridoxine(B6) 1mg/l - Thiamine (B1) 1mg/l - Nicotinic acid 1mg/l - m-Inositol 100 mg/l - Biotine 0,01mg/l - D-Pantothnic acid 1mg/l * Fe EDTA - FeSO4.7H2O 27,8 mg/l - Na2EDTA.2H2O 37,3 mg/l 2.2.2. Nguyên vật liệu
- Điều kiên nuôi cấy
Môi trường Murashige và Skoog (M+S). Môi trường Knudson C.
* Ph: 5,8.
* Ánh sáng 5.O00 lm/m2 *Quang kỳ 14 giờ
* Nhiệt độ 110 0C
2.2.3. Khử trùng mẫu
*Rửa sạch chồi Mokara dưới vòi nước chảy.Dùng dao mổ lột sạch các lá non bao quanh chồi cho đến khi để lộ chồi ngọn
* Dùng gòn lau nhẹ lên thân chồi, ngâm chồi trong xà bông loãng trong 10 phút, rửa cho sạch xà phòng dưới vòi nước chảy.
* Trong tủ cấy, ngâm chồi vào cồn 70 độ trong 1 phút, sau đó cho chồi vào becher có chứa dung dịch javel có nồng độ (1 thể tích javel: 4 thể tích nước cất vô trùng) trong 10 phút, lắc đều tay.
* Dùng kẹp vô trùng cho chồi vừa được khử trùng vào becher vô trùng, rửa các chồi này bằng nước cất vô trùng cho sạch javel (rửa 3 lần).
* Cắt bỏ các mô chết phần gốc chồi, tách bỏ các lá bên bằng kim mũi nhọn để có được một đỉnh chồi mang 4 – 5 tiền phát khởi lá, cấy từng chồi vào ống nghiệm có chứa môi trường. Dùng viết aceton ghi rõ tên giống , ngày cấy, tên môi trường nuôi cấy.
* Đặt tất cả vào phòng nuôi và quan sát.
2.2.4. Khởi tạo PLB từ mô lá
Các mẫu lá thu được từ các chồi sinh dưỡng được cắt theo kích thước 5 x 5 mm. Các mẫu lá được đặt nuôi trên môi trường MS 1/2 bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng thực vật NAA 1mg/l, BA 10 mg/l, Adenin 10 mg/l
Sau 10 tuần nuôi cấy:
Các PLB được hình thành chủ yếu từ các mảnh lá ở phần gốc và ít ở các mảnh lá phần đỉnh. Lá và thân mặc dù có những nét giống nhau về hình thái giải phẫu nhưng khác nhau về cách sinh trưởng và cách sắp xếp các mô. Lá có sinh trưởng tận cùng hữu hạn. Do đó, để có sự phát sinh hình thái mới, đỉnh lá cũng cần phải có sự phân hoá của các tế bào nhu mô để trở về trạng thái mô phân sinh.
Sau một thời gian, các chồi xuất hiện xung quanh mép lá (nơi có vết thương) tiếp tục phát triển trong khi phần mô lá ban đầu bị hoại đi. Phiến lá ban đầu được sử dụng như nguồn dinh dưỡng khởi đầu cho PLB và cho chồi sau này nhưng hệ thống mạch của chồi được hình thành thì hoàn toàn độc lập với hệ thống mạch của mô mẹ.
2.2.5. Sự tái sinh chồi từ PLB
Hình 2.1. Sự hình thành chồi từ hoa Mokara
Theo nhiều tác giả khi tái sinh thành cây con từ PLB chỉ cần sử dụng các môi trường khoáng có bổ sung nước dừa, peptone, khoai tây…mà không sử dụng bất kỳ chất điều hòa tăng trưởng nào. Tanaka và Sakanishi (1985) và Tanaka (1987) đã sử dụng môi trường Knudson C cải tiến, môi trường Hyponex cải tiến, còn Haas-von Schmude (1983,1985) sử dụng môi trường MS trong việc tái sinh cây con từ PLB. Griesbach (1983) sử dụng môi trường Murashige và Skoog cho việc tái sinh cây con từ PLB, trong khi Lin (1986) sử dụng môi trường Knudson C cải tiến có bổ sung BA (1 mg/l) để chuyển PLB thành cây con
2.2.6. Sự ra rễ
Thông thường các chồi tái sinh từ PLB sẽ ra rễ và phát triển mạnh trên môi trường có bổ sung nước dừa, chuối, khoai tây… mà không cần bất kỳ chất điều hòa tăng trưởng nào hết. Tuy nhiên, việc này còn tùy thuộc vào giống. Có một ít giống rất dễ đẻ chồi nách làm chồi chính phân nhánh không phát triển rễ được, lá nhỏ, thân chồi kéo dài, vì vậy, chồi thường tồn tại ở dạng cụm chồi. Để khắc phục điều này, cấy từng chồi riêng lẻ lên môi trường có hormone tăng trưởng IBA với nồng độ 0.5-1 mg/l, chồi sẽ ra rễ dài, lá to. Sau 3-4 tháng nuôi cấy có thể đem cây con ra trồng ngoài ườn ươm.
2.2.7. Chuyển cây ra vườn ươm
Khi cây con cao khoảng 5-7 cm và có từ 3-4 lá thì lúc này ta có thể chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vô trùng có bổ sung các chất dinh dưỡng. Sau một thời gian cây phát triển ổn định ta đem chuyển vào chậu. Sau khi chuyển chậu khoảng một tuần mới được bón phân, lúc này cây đã có đủ sức chống chọi với bệnh tật.
Như vậy, từ một mô hoa Mokara được chọn nuôi cấy cho đến ra cây con có 3-4 lá ta chuyển ra vườn trồng mất thời gian khoảng từ 8 đến 11 tháng.
Như vậy toàn bộ qúa trình nhân giống trên ta được cây con mang đặc tính giống hoàn toàn với cây cha mẹ (cây con ổn định về mặt di truyền), cây con không nhiễm bệnh và tạo được một số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn. Tuy nhiên, việc cấy mô cần thực hiện theo đúng quy trình đã chọn ra tức là phải có điều kiện về trang thiết bị đầy đủ, môi trường nhân tạo thích hợp, đặc biệt là điều kiện vô trùng phải được đảm bảo nghiêm ngặt. Có như vậy ta mới đảm bảo hiệu quả từ khâu nuôi cấy trong phòng thí nghiệm đến trồng ngoài vườn ươm.
Sau khi trình bày một số phương pháp nhân nhanh hoa Mokara sạch bệnh bằng phương pháp in vitro, tôi thấy phương pháp sử dụng đỉnh sinh trưởng là phương pháp cho hiệu quả cao hơn so với những phương pháp khác. Phương pháp này có ưu điểm là tạo ra cây con sạch bệnh, khả năng nhân giống nhanh.Với đặc điểm là hoa cắt cành lại là hoa có hệ số nhân cao nên khi áp dụng nuôi cấy mô hoa Mokara chiếm ưu thế rất lớn cho quá trình sản xuất đáp ứng nhu cầu cho người Việt Nam và thế giới trong tương lai không xa.
Bên cạnh đó, ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô vào nhân nhanh invitro là tiến bộ kỹ thuật đặc biệt sẽ góp phần giải quyết vấn đề nguồn giống cho nước ta, tiết kiệm chi phí mua giống và nâng cao quy mô sản xuất hoa phong Lan từ quy mô nhỏ lẻ, hộ gia đình lên quy mô công nghiệp. Thành công của kỹ thuật nhân nhanh hoa Mokara in vitro còn tạo ý nghĩa thực tiễn to lớn cho xã hội.
Trong thời gian thực hiện đồ án chuyên môn này, tôi đã tiếp thu được một số kiến thức về ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô trong nhân giống cây trồng nói chung và hoa Mokara nói riêng. Tuy nhiên để hoàn thành được đồ án này tôi đã được sự tận tình giúp đỡ của cô Phạm Thị Kim Cúc, cô đã giúp tôi từng bước trong việc thu thập, tổng hợp tài liệu. Với sự chỉ dẫn nhiệt tình của cô tôi đã hoàn thành được đề tài: “ nhân nhanh invitro hoa
Mokara”
Cuối cùng tôi xin cảm ơn nhà trường và khoa công nghệ lương thực thực phẩm đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện đồ án này. Trong quá trình thực hiện đề tài sẽ không tránh khỏi thiếu sót và hạn chế về mặt kiến thức.Vì vậy, tôi mong các bạn cùng thầy cô sữa chữa, đóng góp ý kiến để tôi tiến bộ hơn trong những đề tài sau. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn .Chúc bạn đọc sức khỏe!
-TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1] Trần Văn Bảo ,1999.Kỹ thuật nuôi trồng phong lan,nhà xuất bản trẻ.Trang 5-74 [2] Nguyễn Văn Hiền, nghiên cứu thuốc trừ nấm cho loài hoa phong lan
[3] Trần Hợp ,1998,2000.Phong lam Việt Nam.Nhà xuất bản nông nghiêp TP HCM [4] Dương Công Kiên ,2003, Nuôi cấy mô thực vật II, NXB Đại học quốc gia TP. HCM [5] Bùi Văn Lệ - chủ biên, 2001, Thực tập Công nghệ sinh học thực vật, Trường ĐH Khoa học tự nhiên TP. HCM.
[6,9]Nguyễn Đức Lương và Lê Thị Thùy Tiên, 2002
[7] Trần Văn Minh ,1999, giáo trình công nghệ sinh học thực vật.Viện sinh học nhiệt