2.2.4.2. pH
Mục đích của phương pháp là xác định chính xác độ pH của mẫu bột sau khi qua xử lý chiếu xạ, đánh giá mức độ thay đổi của hàm lượng acid của mẫu bột sau khi qua xử lý chiếu xạ.
Mẫu tinh bột để đo pH được chuẩn bị với 1,0 g tinh bột trong 25ml nước ở nhiệt độ 25°C và khuấy trong 5-10 phút để tạo thành dung dịch huyền phù. Sau đó, pH của dung dịch được xác định bằng pH kế (pH-2012 Pen type pH meter) (Sokhey, 1993).
2.2.4.3. Acid tự do
Mục đích của phương pháp này là xác định sự thay đổi của hàm lượng acid tự do trong tinh bột khoai mỡ sau khi qua xử lý chiếu xạ. Việc này có ý nghĩa quan trọng trong quá trình ứng dụng và bảo quản tinh bột.
Hàm lượng acid tự do trong mẫu tinh bột khoai mỡ được xác định bằng phương pháp chuẩn độ huyền phù tinh bột với NaOH chuẩn nồng độ 0,023N (Sokhey, 1993). Huyền phù tinh bột được chuẩn bị với: 1,0 g tinh bột trong 10ml nước cất, khuấy đều
19
trong 5 - 10 phút. Hàm lượng acid tự do trong mẫu tinh bột được xác định bằng công thức:
FA = (100 x V x 0,023)/ 0,1 (2.1)
Với: FA: hàm lượng acid tự do (ml); V: thể tích NaOH 0,023N dùng để chuẩn độ.
2.2.4.4. Khả năng hòa tan (SI, Solubility) và trương nở (SP, Swelling Power)
Khả năng hòa tan và khả năng trương nở được xác định dựa theo phương pháp của (Leach, et al., 1959). Cân 0,2 g tinh bột khô cho vào ống ly tâm cùng với 10 ml nước cất, lắc đều để hỗn hợp được phân tán đều. Huyền phù tinh bột được đưa vào bể điều nhiệt và ổn định trong 30 phút, mỗi 30 giây lắc đều các ống ly tâm. Bể điều nhiệt được điều chỉnh nhiệt ở 30, 40, 50, 60, 70, 80, và 95°C để khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến mức độ hòa tan và khả năng trương nở của các mẫu tinh bột khoai mỡ. Sau 30 phút, các mẫu tinh bột được làm nguội đến nhiệt độ phòng và ly tâm ở tốc độ 1000 x g trong 20 phút. Phần dịch nổi được thu hồi và sấy khơ ở nhiệt độ 105°C trong vịng 24h.
Khả năng hòa tan (SI, %) và khả năng trương nở (SP, g/g) được xác định theo các công thức sau:
SI = m2/m1 x 100% (2.2)
SP = m3/(m1 - m2) (2.3)
Với: m1: khối lượng tinh bột ban đầu (g); m2: khối lượng dịch nổi sau khi sấy (g); m3: khối lượng cặn lắng sau khi ly tâm (g)
2.2.4.5. Độ nhớt nội tại và khối lượng phân tử trung bình
Mục đích của phương pháp này là xác định một số tính chất động học của tinh bột sau khi hồ hóa như độ phân tán, độ nhớt, khối lượng phân tử trung bình,... Giúp ta đánh giá được hiệu suất hồ hóa và khuynh hướng ứng dụng của tinh bột hồ hóa vào ngành cơng nghệ thực phẩm.
Độ nhớt nội tại (ηi) của các mẫu tinh bột khoai mỡ được thực hiện dựa trên phương pháp của (Harding, 1997) (Bản in). Các mẫu tinh bột khoai mỡ (EB0, EB1, EB3, EB7,
20
EB10) được huyền phù hóa với dung dịch KOH 1M thành một dãy có nồng độ từ 1,0 đến 5,0 mg/ml.
Tỷ trọng dung dịch tinh bột được xác định:
ρ = m/V (2.4)
Với m: khối lượng tinh bột khơ (g); V: thể tích dung dịch (ml)
Sau đó sử dụng nhớt kế mao dẫn để xác định độ nhớt Ostwald có Ø = 0,3 mm (Ref.No 509 03, Đức) (Anastasiades, et al., 2002). Các mẫu sau khi được pha loãng sẽ được ổn định nhiệt trong bể điều nhiệt ở các mức nhiệt độ khác nhau lần lượt từ 30, 40, 50, 60, 70, 80°C (Harding, 1997). Khi đó, độ nhớt động học (η, m2/s, kinematic viscosity) được xác định theo công thức sau (Dokic, et al., 2004):
η = 0.004 x t - 0,12/t (2.5)
Độ nhớt tương đối (ηrel) được xác định như sau:
ηrel = η/ηo (2.6)
Với η là độ nhớt động học (m2/s) của mẫu; ηo là độ nhớt (m2/s) của dung dịch KOH 1 M; t là thời gian (s) chảy của dung dịch mẫu trong nhớt kế; to là thời gian (s) chảy của dung dịch KOH 1 M trong nhớt kế; ρ là tỷ trọng của dung dịch mẫu ở từng mức nhiệt độ; ρo là tỷ trọng của KOH 1 M ở từng mức nhiệt độ.
Độ nhớt reduced (ηred, ml/g) được tính theo cơng thức:
ηred = (ηrel - 1)/c (2.7)
Với c: nồng độ tinh bột trong dung dịch KOH 1 M.
Độ nhớt nội tại ([ηi], ml/g) của mẫu được tính theo cơng thức (Dokic, et al., 2004): [ηi] = lim
𝑐→0η𝑟𝑒𝑑 (2.8)
Mối quan hệ giữa độ nhớt nội tại (intrinsic viscosity) và mức độ polymer hóa (Depolymerization, DP) theo công thức của (Cowie, 1960):
DP = 7,4[ηi] (2.9)
Từ giá trị độ nhớt nội tại ηi, tính được khối lượng phân tử trung bình (Mw) theo cơng thức Staudinger-Mark-Houwink (Wagner, 1985):
[ηi] = K𝑀𝑤𝛼 (2.10)
Trong đó: ηi (ml/g) là độ nhớt nội tại, K = 1,18.10-5 (𝑐𝑚3/𝑔 × (𝑔/𝑚𝑜𝑙)𝛼) và α = 0.89 (còn gọi là hệ số Mark-Houwink) là hằng số được xác định bằng thực nghiệm, Mw (g/mol) là khối lượng phân tử trung bình (Wagner, 1985).
21
2.2.4.6. Khả năng tạo phức với iodine
Mục đích của phương pháp này là định tính và định lượng thành phần của tinh bột, ước tính chính xác tỉ lệ của thành amylose và amylopectin trong tinh bột. Mỗi vòng xoắn trong cấu trúc của chuỗi amylose sẽ hấp thụ một phân tử iot, các phân tử iodine sẽ xen lẫn vào vòng ưa béo của xoắn amylose tạo thành các chuỗi nguyên tử nằm cạnh nhau, nếu khơng có sự tác động của nhiệt, chuỗi nguyên tử này sẽ liên kết chặt với nhau, được gọi là phức amylose-iodine. Phức hợp này hấp thụ bước sóng mạnh nhất ở 620nm và cho màu thẫm (Zhu, 2008).
Cân 100,0 ± 0,1 mg tinh bột chuyển vào bình định mức 100ml, thêm 1 ml ethanol để làm ướt mẫu. Tiếp tục thêm 10ml dung dịch NaOH vào bình định mức để hịa tan mẫu, lắc đều và để yên trong 1 giờ để dung dịch hoàn toàn trong suốt, rồi dùng nước cất định mức đến 100 ml. Hút 2 ml dung dịch này cho vào bình định mức 100ml khác, thêm vào 50 ml nước cất và 2 giọt chỉ thị phenolphtalein. Dùng acid HCl nồng độ 0,1 N để chuẩn độ dung dịch này đến khi pH = 7. Tiếp đến, bổ sung 2 ml dung dịch iodine (2,0 g KI và 0,2 g iodine định mức với nước cất đến 100 ml) (Zhu, 2008).
Định mức dung dịch trên đến 100 ml bằng nước cất và để yên trong 30 phút để dung dịch hấp thụ màu trọn vẹn. Đo độ hấp thụ màu bằng máy quang phổ UV – Vis (Lambda 25, Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts, Mỹ), bước sóng từ 400 đến 800 nm, khoảng cách 2 nm (Zhu, 2008).
Dựa trên độ hấp thụ màu, tính được hàm lượng amylose trong mẫu tinh bột bởi công thức (Zhu, 2008):
Amylose (%) = 𝐴𝐵𝑆620− 𝐴𝐵𝑆510+0.0203
0.5002 (R
2 = 0,9799) (2.11)
Với ABS620, ABS510 lần lượt là độ hấp thu của mẫu tinh bột ở bước sóng đỉnh 620 và bước sóng 510 nm.
2.2.4.7. Hình thái hạt tinh bột (FESEM)
Mục đích của phương pháp này xác định hình thái của mẫu tinh bột và đánh giá mức độ ảnh hưởng của liều xạ lên hình thái của hạt tinh bột. Độ phân giải có thể lên tới nanomet, đây là ưu điểm vượt trội so với các thiết bị hiển vi quang học (Tomoaia-Cotisel, et al., 2010).
22
SEM (Scanning Electron Microscope) là viết tắt của một loại kính hiển vi điện tử có chức năng quét quang phổ, nó có thể tạo ra ảnh của bề mặt mẫu vật rắn với độ phân giải rất cao bằng một chùm điện tử quét trực tiếp trên bề mặt mẫu. Thiết bị chụp ảnh quang phổ sẽ ghi nhận và phân tích, xử lý các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật. (Joseph, et al., 2003).
2.2.4.8. Biến đổi các nhóm chức hóa học (FTIR)
Mục đích xác định các thành phần vơ cơ, hữu cơ trong mẫu, mô tả sự thay đổi cấu trúc tinh bột: sự xuất hiện các nhóm chức khác trong thành phần. Sử dụng máy quang phổ hồng ngoại FTIR (Fourier transform infrared spectroscopy).
Các mẫu tinh bột chiếu xạ được đo ở phổ hồng ngoại FTIR bằng thiết bị đo phổ hồng ngoại FTIR – 4700 (Nhật Bản) với đầu đo Jascoint Atr Pro One ở số sóng từ 400 – 4000 cm-1.
2.2.4.9. Mức độ tinh thể tương đối (XRD)
Mục đích của phương pháp này là xác định mức độ tinh thể và đánh giá sự hình thành hay mất đi của tinh thể sau khi xử lý chiếu xạ. Mẫu tinh bột trước và sau xử lý EB được đo tán xạ tia X (XRD) bằng phương pháp bột. Thiết bị dùng để đo XRD (X-Ray Diffraction) là máy tán xạ tia X của trung tâm MANAR- Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh (Model D5005, Bruker, Karlsruhe, Đức). Thơng số để đo XRD cơ bản gồm: 40 kV và 40 mA với bức xạ α bằng Cu-K bước sóng 0,15418 nm, góc quét từ 5-30o (Nara, 1983; Trinh, 2020). Mức độ tinh thể (DRC) được xác định theo công thức (Nara, 1983):
DRC = 𝐴𝑐
𝐴𝑐+ 𝐴𝑎 (2.12)
Trong đó: Ac: là phần diện tích đặc trưng cho vùng tinh thể;
Aa: là phần diện tích đặc trưng cho vùng vơ định hình (xét trên đồ thị XRD)
Đối với các chất thấp phân tử, giá trị khối lượng phân tử là một hằng số. Tuy nhiên, tinh bột là một polysaccharides (hợp chất cao phân tử - là một hỗn hợp của nhiều đoạn mạch có kích thước khác nhau), vì vậy đối với tinh bột khối lượng phân tử là một giá trị có tính chất thống kê trung bình. Khối lượng phân tử trung bình ảnh hưởng đến các tính chất hóa lý của tinh bột: độ hòa tan, trương nở, độ nhớt, độ bền..
23
2.2.5. Đo khả năng tiêu hóa in vitro
Mục đích của phương pháp này là xác định hiệu suất tiêu hóa của tinh bột và đánh giá mức độ thay đổi sự bị tiêu hóa của tinh bột sau khi được xử lý ở các liều xạ khác nhau. Độ tiêu hóa của tinh bột khoai mỡ được xác định dựa trên phương pháp của (Englyst, et al., 1992), được sửa đổi bởi (Sang, et al., 2007). Dịch enzyme sẽ được chuẩn bị bằng cách cân 2,0 g pancreatin (P7545, 8×USP/g của hãng Sigma–Aldrich) hịa tan trong 24 ml nước cất và khuấy bằng khuấy từ trong 10 phút. Sau đó, ly tâm dung dịch ở 3000×g trong 15 phút. Lấy 20 ml dịch nổi sau ly tâm pha với hỗn hợp gồm 3,6 ml nước cất và 0,4 ml amyloglucosidase (AMG 300L, hoạt độ 300 U/ml của hãng Novozymes, Đan Mạch). Hỗn hợp enzyme này được đặt trong bể điều nhiệt (Memmert - WNB14, Goettingen, Đức) ở 37℃ trong 10 phút. Mẫu tinh bột được cân chính xác 0,1200 g bằng cân 4 số cho vào ống ly tâm (centrifuge tube) thể tích 15 ml với ba hạt bi thủy tinh. Cho 3,0 ml dung dịch đệm natri acetate (0,1 M; pH 5,2) vào ống ly tâm trên. Sau đó chuyển ống này vào bể điều nhiệt có nhiệt độ 37℃ trong 10 phút. Cho thêm 3,0 ml dung dịch enzyme đã chuẩn bị sẵn vào và lắc liên tục. Thời gian thực hiện phản ứng là 10 và 240 phút. Bất hoạt enzyme bằng cách đun sôi trong 10 phút và để nguội. Sau đó, ly tâm (Máy ly tâm của Hettich Instruments – EBA 21, Tuttlingen, Đức) ở 4000×g trong 10 phút để thu dịch nổi (Sang, et al., 2007).
Xác định nồng độ glucose của dịch nổi thu được bằng phương pháp DNS (Miller, 1959; Warwick, et al., 1982; James C. S., 1995) thông qua đường chuẩn glucose (Phụ lục 2) RDS và SDS được xác định dựa vào hàm lượng đường sinh ra sau 10 và 240 phút enzyme xúc tác thủy phân tinh bột. RS là phần cịn lại khơng tiêu hóa sau 240 phút.
2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thí nghiệm được xử lý ANOVA một yếu tố bằng phần mềm SPSS 27 (SPSS Institute Inc., Cary, NC, USA) với kiểm định đa khoảng Duncan (Duncan's Multiple Range Test) (p ≤ 0.05) để phân tích sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình.
24
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Các chỉ tiêu hóa học cơ bản
Hiệu suất thu hồi tinh bột khoai mỡ được tính theo cơng thức: H (%) = 𝑚2
𝑚1 * 100 = 15.41
113.70 * 100 = 13.55 (%) (2.13)
Với: m1: khối lượng khoai mỡ ban đầu (kg); m2: khối lượng tinh bột khoai mỡ thu được (kg).
Bảng 3.6: Các chỉ tiêu hóa học cơ bản của tinh bột khoai mỡ thô
Chỉ tiêu Hàm lượng (%) Carbohydrates* 85.7 Béo* < 0.3 Protein* < 0.3 Độ ẩm* 13.9 Tro tổng* 0.16
* Được phân tích bởi cơng ty TNHH EUROFINS Sắc Ký Hải Đăng (Phụ lục 13).
3.2. pH và acid tự do
Giá trị pH và hàm lượng acid tự do (FA, g/ml) của mẫu tinh bột chưa qua xử lý chiếu xạ và mẫu tinh bột đã xử lý chiếu xạ được thể hiện ở hình 3.5.
. y = 0.6224x + 2.9859 R² = 0.9252 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 F A (m l) Liều xạ (kGy) y = -0.0577x + 6.8356 R² = 0.9885 6.20 6.30 6.40 6.50 6.60 6.70 6.80 6.90 0 2 4 6 8 10 pH Liều xạ (kGy)
25
Kết quả nghiên cứu cho thấy, giá trị FA của mẫu tinh bột xử lý chiếu xạ cao hơn so với mẫu tinh bột tự nhiên. Theo các nghiên cứu, nồng độ acid tự do sau khi xử lý chiếu xạ tinh bột tăng là do quá trình bẻ gãy liên kết glycosidic trong phân tử tinh bột dưới tác dụng của gốc tự do và hình thành nhóm COOH (Sokhey, 1993). Theo một số nghiên cứu thì các phản ứng phân cắt mạch để hình thành gốc COOH chiếm ưu thế trong suốt quá trình xử lý chiếu xạ tinh bột (Shishonok, 2007). Đồng thời, khi xử lý chiếu xạ các mẫu tinh bột, một lượng nhỏ hydrogen peroxide được hình thành (Raffi, 1981) và hình thành acid formic dưới sự xúc tác của enzyme catalase. Nồng độ acid tự do tăng dẫn đến giá trị pH của tinh bột giảm, giá trị giảm này tuyến tính với liều chiếu xạ. Kết quả của chúng tơi phù hợp với với các nghiên cứu của tác giả (Pimpa, 2007) và (Henderson, et al., 1981). Kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng FA trong mẫu tinh bột khoai mỡ sau khi xử lý chiếu xạ EB cao hơn hàm lượng FA trong mẫu bột chưa xử lý. Hàm lượng acid có xu hướng tăng khi tăng liều lượng chiếu xạ. Điều này có ý nghĩa tích cực trong việc bảo quản và ứng dụng tinh bột vào sản xuất.
3.3. Khả năng hòa tan (SI, Solubility) và khả năng trương nở (SP, Swelling Power) Power)
Hình 3.7 cho thấy khả năng hịa tan của các mẫu tinh bột đã xử lý EB cao hơn so với mẫu tinh bột chưa xử lý. Dưới tác dụng của chiếu xạ, tinh bột xảy ra hiện tượng bẻ gãy mạch phân tử tạo ra các phân tử có kích thước ngắn hơn và giảm vùng kết tinh trong hạt tinh bột, từ đó làm tăng khả năng hydrat hóa của hạt tinh bột dẫn đến tăng độ hịa tan. (Shishonok, 2007). Đồng thời, khi hạt tinh bột có xu hướng mất liên kết, các hạt tinh bột đẩy nhau, nó làm căng thẳng các tinh thể lân cận và có xu hướng phá hủy chúng. Việc làm nóng thêm dẫn đến sự phân chia không liên kết của các vùng xoắn ốc đôi và phá vỡ cấu trúc tinh thể amylopectin (Pimpa, 2007). Dưới tác dụng của nhiệt độ, các hạt tinh bột chuyển động nhanh hơn. Theo khuynh hướng tăng lên của nhiệt độ dung môi, độ tan của tinh bột tăng.
26 Hình 3.7: Đồ thị biểu thị khả năng tan (SI, %)
của các mẫu tinh bột