CHƢƠNG 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu
2.3.1. D ng c
- Ống Eppendorf 1,5 mL; 0,5 ml; 0,2 ml - Ống lấy máu chống đông EDTA
- Máy Gene Amp PCR System 9700 (USA) - Pipet, đầu côn các loại
- Tủ lạnh sâu: -30°C; -80°C (SANYO) - Máy điện di: Mupid (Nhật Bản)
- Máy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA) - Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) và ly tâm để bàn Eppendorf (Đức) - Lị vi sóng
- Máy đọc trình tự gen ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Hoa Kỳ)
2.3.2. Hố chất
* Hóa chất dùng để tách chiết DNA, RNA:
- Dung dịch Lysis buffer - Dung dịch SDS 10% - Dung dịch K
- Proteinase K
- Dung dịch phenol: chloroform: isoamyl (tỷ lệ 25 : 24 : 1) - Dung dịch chloroform: isoamyl ( tỷ lệ 24 : 1)
- Sodium acetate 3M, pH=5,2 - Ethanol 100%; ethanol 70% - Mơi trường Mono-polyresolving - Isogen
* Hố chất để thực hiện kỹ thuật PCR - Buffer 10x
- Taq polymerase - Các cặp mồi
* Hoá chất để thực hiện tổng hợp cDNA - Random primer
- PCR buffer 5X:
- DTT 0,1M (ức chế enzym proteinase) - HPRI (ức chế enzym RNAase)
- MMLV – RT (enzym reverse transcriptase) * Hoá chất để điện di sản phẩm PCR + Agarose + Dung dịch TBE 10X + Loading buffer 10X + Ethidium bromide * Hoá chất để đọc trình tự gen
BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit
(Applied Biosystems) gồm BigDye Terminator v3.0 (dATP, dCTP, dGTP và dUTP), BigDye buffer, cặp mồi đặc hiệu, dung dịch formamide.
* Hóa chất để tinh sạch DNA
- Dung dịch phenol: chloroform : isoamyl với tỷ lệ 25 : 24 : 1 - Dung dịch chloroform : isoamyl với tỷ lệ 24 : 1
- Ethanol 100%; ethanol 70% - Hòa tan bằng nước tinh khiết
* Hóa chất để thực hiện phản ứng MLPA:
- SALSA MLPA Kit P034-A2 / P035-A2 DMD/Becker
- Bộ hóa chất chứa 80 đoạn dò (probe) cho 79 exon đích và exon DP427c, chia đều vào hai hỗn hợp probe P034 và P035.
- Thành phần hóa chất:
SALSA MLPA Buffer: KCl, Tris-HCl, EDTA và PEG-6000, pH 8.5 SALSA Ligase-65: Glycerol, BRIJ 0.05%, EDTA, KCl, Tris-HCl, Beta-
Mercaptoethanol 0.1%, pH 7.5, Ligase-65 enzyme (từ vi khuẩn).
Ligase buffer A: NAD (nguồn gốc vi khuẩn), pH 3.5
Ligase buffer B: Tris-HCl, non-ionic detergents, MgCl2, pH 8.5
SALSA PCR Primer Mix: chứa oligonucleotides tổng hợp có gắn huỳnh quang Cy5, dNTPs, Tris-HCl, KCl, EDTA, BRIJ 0.04%, pH 8.0
SALSA Polymerase: Glycerol, BRIJ 0.5%, EDTA, DTT 0.1%, KCl,
Tris-HCl, Polymerase enzyme (nguồn gốc vi khuẩn), pH 7.5
Probemix: chứa oligonucleotides tổng hợp, oligonucleotides tinh chế từ vi khuẩn, Tris-HCl, EDTA, pH 8.0
Bảo quản: hóa chất được bảo quản ở nhiệt độ -250C đến -150C, bảo quản trong hộp và tránh ánh sáng.
hành phần hỗn hợp probe (probemix):
Probemix P034-A2 chứa 45 probe khác nhau với sản phẩm khuếch đại có độ dài từ 129 đến 490nt và có 10 đoạn chứng tạo ra những sản phẩm khuếch đại có kích thước nhỏ hơn 120nt [có 2 probe đặc hiệu cho NST Y (105-118 nucleotid)].
Probemix P035-A2 chứa 45 probe khác nhau với sản phẩm khuếch đại có độ dài từ 129 đến 490nt và có 9 đoạn chứng tạo ra những sản phẩm khuếch đại có kích thước nhỏ hơn 120nt [có 1 probe đặc hiệu cho NST Y (105 nucleotid)].