Chƣơng 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.3. Phương phỏp nghiờn cứu
2.3.1. Kỹ thuật tỏch chiết DNA từ mỏu ngoại vi
Cỏc mẫu DNA được tỏch chiết từ mỏu ngoại vi theo phương phỏp Phenol/chloroform
Nguyờn tắc cơ bản bao gồm cỏc bước: Loại hồng cầu và phỏ vỡ màng tế bào Phỏ vỡ màng nhõn Loại protein Tủa DNA Rửa tủa Hũa tan DNA
Quy trỡnh cụ thể:
- Mỏu tươi chống đụng EDTA cần tỏch trong vũng 24 giờ.
- Cho 0,5 mL mỏu tươi toàn phần chống đụng bằng EDTA vào ống Eppendof 1,5 mL, thờm vào 0,5 mL dung dịch Lysis buffer rồi ủ trờn đỏ trong 10 phỳt.
- Ly tõm 8000 vũng/ phỳt trong 10 phỳt ở 4oC, loại bỏ dịch nổi và thu cặn. quỏ trỡnh này được lặp lại 3 lần.
- Cho vào 0,5 mL dung dịch K , ly tõm 10 phỳt tốc độ 8000 vũng/ phỳt ở 4 oC, loại bỏ dịch nổi và thu cặn.
- Cho 0,5 mL Lysis buffer; 12,5 àL SDS 10%; 10 àL proteinase K, sau đú ủ 2h ở 56 o
C.
- Cho 0,5 mL phenol: chloroform: isoamyl, ly tõm 10000 vũng/phỳt trong 10 phỳt ở 4 o
C, hồn hợp được chia làm 3 phần: lớp dung dịch phớa trờn cú chứa DNA, lớp ở giữa là cặn tế bào, lớp dưới cựng là dịch chiết. Hỳt lấy phần dịch chứa DNA trờn cựng.
- Cho 0,5 mL chloroform:isoamyl, ly tõm mẫu ở 10.000 vũng/phỳt trong 10 phỳt ở 4 o
C, hỳt lấy phần dịch trờn cựng.
- Tủa DNA bằng 1 mL cồn tuyệt đối, cho thờm 50 àL sodium acetat, để lạnh ở -20 oC trong 4 giờ.
- Ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 20 phỳt ở 4 oC, đổ dịch nổi phớa trờn, thu tủa.
Phương phỏp quang phổ
Nguyờn lý đo mọ̃t độ quang học
- Acid nucleic cú phổ hấp phụ cực đại ở bước súng 260 nm là do sự cú mặt của base purin và base pyrimidin. Giỏ trị mật độ quang ở bước súng 260nm (OD260nm) của cỏc mẫu cho phộp xỏc định nồng độ acid nucleic cú trong mẫu nghiờn cứu.
- Protein hấp thụ ỏnh sỏng tử ngoại ở bước súng 280nm do sự hấp thụ của cỏc acid amin nhõn thơm và dị vũng, bao gồm: tyrosin, tryptophan và phenylalanin.
- Dựa vào tỷ lệ OD260nm/OD280nm để kiểm tra độ tinh sạch của DNA. Nếu OD260nm/OD280nm = 1,8 2 thỡ DNA được coi là tinh sạch.