(b) Phụ thuộc vào nồng độ GC trong đoạn DNA sợi đụi đớch ban đầu mà một chương trỡnh phự hợp sẽ được cài đặt để nõng nhiệt độ lờn từ từ (thường từ 50-70oC) để làm tăng hiệu suất biến tớnh một phần. Những chuỗi kộp dị hợp mới hỡnh thành kộm bền với nhiệt sẽ biến tớnh với tỷ lệ tăng dần (nhưng vẫn chỉ biến tớnh một phần), sau đú sẽ giảm thời gian lưu giữ trong pha tĩnh (của chất nền phõn ly sắc ký). (c) Phụ thuộc vào một vài yếu tố như kớch thước của đoạn gen đớch ban đầu, cột nhiệt độ cài đặt, ảnh hưởng của cỏc base lõn cận đến những cặp base bắt cặp đỳng hoặc bắt cặp sai mà cả bốn alen khỏc nhau sẽ tỏch ra hoàn toàn hoặc một phần. Từ đú, sẽ xuất hiện những đỉnh tớn hiệu khỏc nhau tương ứng trờn sắc ký đồ.
Nhờ khả năng của pDHPLC giỳp phỏt hiện một khoảng rộng cỏc trỡnh tự đột biến với độ nhạy cao và ngưỡng phỏt hiện alen đột biến thấp trong một quy trỡnh đó chuẩn húa và ớt tốn kộm, cỏc nhà nghiờn cứu đó sử dụng kỹ thuật này để tầm soỏt cỏc đột biến gen.
Kỹ thuật này ỏp dụng phỏt hiện cỏc đột biến trờn cỏc exon của gen. Sau khi được điện di trờn gel agarose để khẳng định chớnh xỏc kớch thước đoạn DNA mong muốn, sản phẩm PCR mỗi exon sẽ được cho biến tớnh ở 95oC trong 4 phỳt rối làm lạnh xuống 25oC với tốc độ 1,2oC/phỳt để tạo thành cỏc chuỗi kộp dị hợp. Sau đú, cỏc sản phẩm này sẽ lần lượt được đưa vào mỏy sắc ký để thực hiện phõn tớch pDHPLC. Cỏc mẫu đột biến được trỡnh bày cựng với alen kiểu dại và mẫu nước (chứng õm) để đối chứng.
1.9.3. Phõn tớch cấu trỳc đa hình thỏi chuỗi đơn: (Single - Strand Conformation
Polymorphism analysis - SSCP)
* Nguyờn tắc chung: Kỹ thuọ̃t SSCP gụ̀m 2 giai đoạn
- Giai đoạn 1: Đoạn DNA đớch được khuyếch đại nhờ phản ứng PCR - Giai đoạn 2: Sản phẩm PCR được biến tớnh và phõn đoạn nhờ điện dỉ trờn gel Polyacrylamid ở điều kiờn khụng biến tớnh. Sau khi bị biến tớnh bởi nhiệt độ khả năng di chuyển của cỏc phõn đoạn DNA khi điện di trờn gel polyacrylamid phụ thuộc vào cấu trỳc bậc 2 nội phõn tử của chuỗi đơn (tạo ra do sự cặp đụi của cỏc base). Như vậy, so với sợi đụi DNA đối chứng khi điện dỉtờn gel polyacrylamid, sẽ cú hai vạch tương ứng với mỗi sợi đơn của phõn tử DNA ban đầu. Nếu cỏc sợi DNA đớch chỉ khỏc với DNA đối chứng 1 đụi base thỡ cỏc sợi đơn DNA này sẽ cú cấu trỳc khỏc nờn cú thể phõn biệt nhờ gel polyacrylamid ở trạng thỏi khụng biến tớnh.Sự khỏc biệt này được xỏc định trờn cơ sở khỏc biệt về tốc độ di chuyển giữa sợi DNA đớch (cú đột biến điểm) với sợi DNA đối chứng. Thụng thường người ta kết hợp sử dụng
nucleotide được gắn α32P trong phản ứng PCR ở giai đoạn đầu để đỏnh dấu cỏc đoạn gen đớch đó được khuyếch đại này. Gel polyacrylamid sau đú được chụp hỡnh phúng xạ hoặc mỏy xạ hỡnh phosphor. Phương phỏp kết hợp này được gọi là PCR-SSCP. Ưu điểm của phương phỏp này là chỉ cần một một lượng nhỏ DNA khuụn (5-10ng) so với kỹ thuật SSCP truyền thống (5-10 àg). Một phương phỏp khỏc sử dụng cỏc chất nhuộm như SYBR green II. Thuốc nhuộm này cú độ nhạy cao hơn ethidium bromide, được sử dụng phổ biến tron kỹ thuật phõn tớch SSCP khụng sử dung chất phúng xạ.