cách cạnh dưới bản mỏng 10 mm, cách cạnh bên 15 mm, tốc độ 50 nl⁄s.
-_ Triển khai:
+ Dùng máy triển khai sắc ký tự động ADC2.
+ Kiểm sốt độ âm: dung dịch KSCN bão hịa trong 10 phút.
+ Bão hịa bình triển khai 260 x 10 trong 20 phút bằng 25 ml dung mơi pha
động.
+ Thể tích dung mơi khai triển: 10 ml.
+ Khoảng cách khai triển là 70 mm kể từ vị trí chấm. + Sấy khơ bản mỏng trong 5 phút. + Sấy khơ bản mỏng trong 5 phút.
- Hiện vết:
+ Ánh sáng UV tại bước sĩng 254 nm.
+ Thuốc thử hiện vết: Tham khảo tài liệu và khảo sát các thuốc thử hiện vết.
- Chup anh sac ký đồ: Buồng chụp Camag. -_ Xử lý kết quả: Phần mềm Wincats, Videoscan.
So sánh các vết trên sắc ký đồ giữa cao đặc Hịe giác với được liệu nguyên liệu,
dược liệu chuẩn và chất chuẩn về số vết, vị trí, màu sắc và độ đậm nhạt.
2.3.2. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng cao đặc Hịe giác bằng HPLC 2.3.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích
e Mẫu nghiên cứu:
Cao đặc Hịc giác.
Dược liệu chuẩn Hịe giác.
Chat chuẩn sophoricosid.
e Chuẩn bị các dung dịch thử, dung dịch chuẩn:
Dung địch chuẩn: Cân chính xác 2,17 mg chất chuẩn SOP (99,34%) cho vào bình định mức 10 ml, thêm 8 ml methanol 50%, siêu âm đến khi tan hồn tồn, thêm methanol
50% đến vạch thu được dung dịch chuẩn gốc (chuẩn A) cĩ nồng độ 215,57 ug/ml. Pha dãy 5 dung dịch chuẩn SOP (B, C, D, E, F) bằng cách pha lỗng dung dịch chuẩn gốc bằng methanol 50%.
Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,1000 g cao đặc Hịe giác vào bình nĩn cĩ
nút mài 100 ml, thêm chính xác 25 ml dung mơi. Siêu âm 30 phút, để nguội. Cân lại, bổ
sung khối lượng mất đi bằng dung mơi, lắc đều thu được dịch chiết. Lấy chính xác 1 ml
dịch chiết cho vào bình định mức 5 ml, thêm methanol 50% đến vạch, lắc đều. Lọc qua
màng lọc 0,45 um thu được dung dịch tiêm sắc ký. Khảo sát dung mơi chiết methanol và ethanol ở các nồng độ khác nhau đề cĩ được lượng sophoricosid nhiều nhất.
Dung dịch dược liệu chuẩn và dung dịch được liệu: Cân chính xác khoảng 0,1000 8 lần lượt các mẫu dược liệu chuẩn Hịe giác và dược liệu Hịe giác. Tiến hành chuẩn bị
mẫu như với dung dịch thử.
© Điều kiện sắc ký
Tham khảo DĐTQ 2015 [13], khảo sát và lựa chọn được chương trình sắc ký lỏng
với các điều kiện sắc ký phù hợp:
- Pha tinh: Cot Silica gel C18 (ODS) (150 x 4,6 mm, 5 pm). - Detector: UV 260 nm.
- Téc dé dong pha déng: 1,0 ml/phút. - Nhiét d6 cdt: 40 °C.
- Pha d6ng: Methanol — acetonitril — acid phoshoric 0,07% (12 : 20 : 68).
a. Định lượng:
Tiêm riêng biệt 10 ul các dung dịch chuẩn vào máy sắc ký, ghi nhận sắc ký đồ, diện tích pic của SOP. Xây dựng đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch chuẩn (ug/ml) theo phương trình y = ax + b, với y là
dién tich pic (mAU.s) và x là nong độ dung dịch chuẩn (ug/ml).
Tiêm 10 pl dung dich thw, ghi nhận sắc ký đồ, thời gian lưu và diện tích pic.
Nhận dạng pic SOP trên sắc ký đồ của dung dịch thử bằng cách so sánh thời gian lưu với pic trên sắc ký đồ dung dịch chuân SOP. Thời gian lưu của pic SOP tir hai sac ký đồ khơng khác biệt quá 5,0%.
Nồng độ SOP trong dung dịch thử (ug/m]) được tính theo cơng thức (1), hàm lượng SOP trong cao khơ tuyệt đối được tính theo cơng thức (2).
St-b C= (1) a X(®)=Cx——— ®)= 'X mx(100—H) (2) 2 Trong do:
Cr: Néng d6 SOP trong dung dich thir (ug/ml).
Se Dién tich pic cua SOP trên sac ky đồ của dung dịch thử (mAU.s).
a: Giá trị hệ số gĩc của đường hồi quy tuyến tính.
b: Giá trị hệ số chắn của đường hồi quy tuyến tính.
X: Hàm lượng SOP trong cao khơ tuyệt đối (%). m: Khối lượng cao đặc (g).
H: Độ ẩm cao đặc (%).
b. Định tính:
Từ kết quả sắc ký đồ của phần định lượng, ghi nhận thời gian lưu của pic SOP trong sắc ký đồ của sophoricosid chuẩn và thời gian lưu của các pic đặc trưng trên sắc ký đồ của dung dịch thử. Cần xây dựng vân tay sắc ký lỏng hiệu năng cao của cao đặc Hịe giác với các pic đặc trưng để tiến hành định tính cao đặc Hịe giác bằng HPLC.
Nhận dạng pic SOP trên sắc ký đồ của dung dịch thử bằng cách so sánh thời gian
lưu với pic trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn SOP. Thời gian lưu của pic SOP từ hai sắc
ký đồ khơng khác biệt quá 2,0%.
Thời gian lưu tương đối của các pic đặc trưng phải tương ứng so với các giá trị trong vân tay sắc ký được xây dựng. Tính tốn thời gian lưu tương đối (RRT) của các pic đặc trưng theo thời gian lưu (RT) theo cơng thức:
RT pi
BRT = Fe soF
Trong do:
RTpic 14 thoi gian luu cua pic dang tinh RRT (phut).
RTpi sop là thời gian lưu của pic SOP trên sắc ký đồ đĩ (phút).
2.3.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích sophoricosid trong cao đặc Hịe giác
Tiến hành sắc ký các dung dịch đã được xử lý theo quy trình xử lý mẫu ở trên theo
điều kiện được chọn, thẩm định phương pháp theo các chỉ tiêu: Độ đặc hiệu, độ thích
hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng [I], [11], [19].
a. Tính thích hợp hệ thơng
Để xác định tính thích hợp của hệ thống, tiến hành sắc ký 6 lần dung dịch chuẩn
SOP, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic tương ứng và số đĩa lý thuyết. Độ
Yêu câu: Hệ thơng được coi là thích hợp nếu RSD < 2,0% với cả thời gian lưu,
diện tích pic và sé dia ly thuyết; số đĩa lý thuyết khơng dưới 3.000. b.Đơ đặc hiệu
Tiến hành: Chạy sắc ký lần lượt với các mẫu sau: - Dung méi pha mau. - Dung méi pha mau.
- Dung dich chuan sophoricosid.