Sau khi kết thúc phản ứng, sản phẩm PCR đặc hiệu sẽ đƣợc tinh sạch và
xử lý với enzym cắt giới hạn đã đƣợc lựa chọn nhằm tạo ra những phân đoạn DNA nhỏ hơn. Sau khi đƣợc điện di trên gel agarose, số lƣợng và chiều dài các đoạn DNA này sẽ giúp phát hiện các trƣờng hợp đột biến. Phƣơng pháp phát hiện đột biến gen EGFR bằng kỹ thuật PCR-RFLP dựa trên nguyên lý :
exon 21 của gen EGFR kiểu dại có vùng trình tự đặc hiệu cho enzym MscI,
đột biến tại exon 21 gen EGFR làm mất vị trí cắt của enzym do đó sản phẩm
PCR không bị cắt bởi enzym MscI [117]. Với thiết kế kỹ thuật tƣơng tự nhƣ khi tìm đột biến gen EGFR, sản phẩm khuếch đại codon 12 gen KRAS sẽ
đƣợc xử lý với enzym NlaI và codon 13 với HaeIII [118]. Sau khi phân cắt,
các sản phẩm sẽ đƣợc phân tích kết quả trên thạch agarose. Đây là phƣơng pháp truyền thống, kinh tếnhƣng rất hiệu quảvà cho độ tin cậy cao.
1.3.2. Kỹ thuật giải trình tự gen
Đoạn DNA cần đƣợc giải trình tự đƣợc sử dụng nhƣ trình tự mẫu cho phản ứng giải trình tự bắt đầu từ vị trí gắn mồi. Hỗn hợp của deoxy- và
dideoxynucleotid đƣợc sử dụng trong phản ứng với nồng độ sao cho các
dideoxynucleotid sẽ gắn vào mỗi vị trí mà các deoxynucleotid thƣờng gắn
trên đoạn DNA đang đƣợc tổng hợp. Sự gắn của các dideoxynucleotid sẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài các đoạn DNA đƣợc tổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích thƣớc khác nhau. Nucleotid tận cùng trên mỗi sợi DNA đƣợc xác định bằng cách chạy một phản ứng hỗn hợp nhƣng từng loại dideoxynucleotid đƣợc đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang đặc hiệu khác nhau.
Sản phẩm sau phản ứng giải trình tự sẽ đƣợc đọc trình tự bằng máy giải
trình tự tự động sử dụng bảng gel polyacrylamide. Máy gồm 2 phần: phần dùng điện di gel, phần phát hiện các vạch điện di. Các vạch điện di đƣợc các con mắt cảm quang phát hiện khi đi qua chùm tia laser và phát sáng lên. Tín hiệu đƣợc mắt cảm quang truyền về máy tính để hiển thị thành các đỉnh cƣờng độ sáng. Sau đó, trình tự gen của mẫu nghiên cứu sẽ đƣợc đối chiếu với trình tự gen tham chiếu trên ngân hàng gen thế giới (GenBank) và đƣợc
phân tích đểxác định vùng hoặc điểm đột biến.
Do các đột biến gen EGFR trên exon 18 ÷ 21 và đột biến gen KRAS rất đa
(A) Hình ảnh đột biến xóa đoạn gen (B) Hình ảnh đột biến điểm