- Nuôi cấy lắc trong 5 ml môi trường dịch thể YG ở nhiệt độ 28oC
- Lấy 1,5 ml dịch nuôi cấy, ly tâm với tốc độ 16000g trong 5 phút ở 4oC, thu sinh khối - Rửa bằng TE
- Thêm 500 μl EDTA 5mM (pH 8,0), trộn đều
- Thêm 50 μl lysozym (0,75 mg trong 1 ml Tris-HCl 10mM pH 8,0), trộn, giữ ở 37oC trong 1 giờ
- Thêm 50 μl SDS 20%, 50 μl proteinase K (4 mg trong 1 ml Tris-HCl 50mM pH 7,5), trộn, giữ ở 55oC trong 30 phút
- Thêm 400 μl phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1), trộn đều, ly tâm với tốc dộ 16000g trong 10 phút ở 4oC, thu lớp trên. Thực hiện 3 lần.
- Thêm 1/10 thể tích Natriacetate 3M, 1 thể tích propanol, trộn đều - Thu ADN bằng đũa thủy tinh
- Rửa trong 500 μl ethanol 70% trong 30 giây, để khô tự nhiên - Thêm 500 μl TE
Nếu sử dụng mẫu ADN để tiến hành thí nghiệm lai ADN, cần làm tiếp các bước sau:
- Thêm 50 μl RNase A (1 mg trong 1 ml Tris-HCl 50mM pH 7,5), 0,5 μl RNase T1, giữ ở 37oC trong 20 phút
- Thêm 50 μl proteinase K, giữ ở 37oC trong 1 giờ
- Thêm 400 μl phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1), trộn đều, ly tâm với tốc dộ 16000g trong 10 phút ở 4oC, thu lớp trên. Thực hiện 3-4 lần.
- Thêm 1/10 thể tích Natriacetate 3M, 1 thể tích propanol, trộn đều - Thu ADN bằng đũa thủy tinh
- Rửa trong 500 μl ethanol 70% trong 30 giây, để khô tự nhiên - Thêm 100-200 μl TE
Các số liệu trên được lấy từ sách Bergey’s manual systematic of bacteriology và sách Identification manual of actinomycetes.