1. 30-50mg tế bào khô + 1ml H2SO4 1N, lắc nhẹ, vặn chặt nút, giữ ở 100oC trong 2 giờ. 2. Để nguội, chuyển sang cốc thủy tinh, chỉnh pH 5.2-5.5 bằng dung dịch Ba(OH)4 bão hòa. 3. Chuyển sang ống eppendorf. Ly tâm với tốc độ 3000 rpm trong 5 phút, chuyển dịch trên
sang cốc thủy tinh, làm khô bằng hút chân không
4. Hòa tan bằng 300 μl DW, chuyển sang ống eppendorf, ly tâm với tốc độ 3000rpm trong 5 phút, lấy dịch trên, lọc mẫu.
5. Chạy sắc ký bản mỏng TLC: - TLC cellulose
- 3 μl mẫu - 1 μl chuẩn
Chuẩn 1: galactose, arabinose, xylose 0.1% (w/v) hòa tan trong nước
Chuẩn 2: rhamnose, mannose, glucose, ribose 0.1% (w/v) hòa tan trong nước Chuẩn 3: madurose (3-O-methyl-D-glucose) 0.1% (w/v) hòa tan trong nước - Dung môi chạy TLC: n-buthanol:water:pyridine:toluene= 10:6:6:1 (v/v)
- Để khô, phun Acidity phthalate aniline (phtalic acid 3.25g hòa tan trong 100 ml dung dịch n-buthanol bão hòa, thêm 2ml aniline). Giữ ở 100oC trong 4 phút
- Chuẩn bị dung dịch n-buthanol bão hòa: DW + n-buthanol (1:1), cho vào bình tách mẫu, lắc trộn đều, loại lớp dưới
Chuẩn 1: Glucose: vàng Mannose: vàng Ribose: đỏ Rhamnose: vàng Chuẩn 2: Galactose: vàng Arabinose: đỏArabinose: đỏ
Xylose: đỏ Chuẩn 3: Madurose: vàng
6. Điều kiện chạy HPLC: - Cột: cột trao đổi anion
- Dung dịch A: Acid boric 0.1 M + Hòa tan 6,2g acid boric trong 1L DW + Thêm KOH 4M đến pH 8
- Dung dịch B: Acid boric 0.4M
- + Hòa tan 24,8g acid boric trong 1L DW + Thêm KOH 4M đến pH 9
- Tốc độ dòng chảy: 0,5ml/min - Nhiệt độ: 65oC
- Phản ứng nhận biết:
Dung dịch C: 5g arginine + 15g acid boric trong 500ml DW Tốc độ dòng chảy: 0,5ml/min
Nhiệt độ: 150oC
Bước sóng: Ex=320nm, Em=430nm Chương trình
Thời gian (phút) Nồng độ Sol B
0 0 Dung dịch C: 0.2ml/min
50 100 57 100 57.1 0 100 57.1 0