Photobiotin có tên khoa học N- (4- azido- 2- nitrophenyl)- N’- (N- d- biotynyl- 3- aminopropyl)- N’- methyl- 1,3- propanediamine.
Photobiotin là một đồng phân của biotin mẫn cảm với ánh sáng (hinh 2.12). Gốc có hoạt tính với ánh sáng “aryl azide” được gắn vào biotin thông qua một nhánh đã nạp năng lượng gọi là “linker”. Khi photobiotin phát quang với ánh sáng thấy được rất rõ, sự hiện diện của nucleotide đã được đánh dấu (Bùi Chí Bửu vá Nguyễn Thị Lang, 2000).
Phương pháp đánh dấu photobiotin là một phản ứng hóa học, không phải là một phản ứng enzyme. Vật liệu trong đánh dấu photobiotin bền hơn và rẻ hơn so với phản
Hình 2.12Đánh dấu “end labelling” dùng enzym polynucleotide kinase (PNK)
(a) DNA được dephosphoryl hóa bằng phosphatase, để tạo các nhóm 5’- OH. (b) Sau đó đuôi phosphate của [γ32P] được chuyển sang đầu 5’ bằng PNK. Đây là phản ứng trao đổi các đầu phosphate.
ứng enzyme. Đây là một phương pháp nên được áp dụng trong trường hợp sử dụng một số lượng lớn thể probe mà không cần phải quá nhạy cảm (Karcher, 1996).
Cơ chất chemiluminogenic đối với men alkaline phosphatase
Cơ chất chemiluminogenic có tính chất dioxetane đã được dùng trong hệ thống digoxigenin hoặc biotin- streptavidin. Một số chất dẫn xuất của 1,2- dioxetane khá ổn định sẽ truyền sáng khi nó phản ứng với enzyme (Beck và Koster, 1992). Người ta thường sử dụng 1,2- dioxetane có một gốc phosphate phản ứng trực tiếp với enzyme “alkaline phosphatase”. Men này có thể liên kết trực tiếp với phân tử DNA, hay nó đóng vai trò như một probe, hoặc liên kết đồng hóa trị với streptavidin, rồi sau đó gắn với thể probe có đánh dấu biotin. Men alkaline phosphatase có thể liên kết đồng hóa trị với một kháng thể nào đó, mà kháng thể này đối nghịch với hapten, thí dụ như digogenin. Những cơ chất chemiluminogenic đối với alkaline phosphatase bao gồm PPD (hình) và CSPD. PPD còn được gọi là AMPPD, nó chính là 4- methoxy-4- (3- phosphatephenyl) spiro [1,2- dioxetane- 3,2- adamantane]. CSPD là disodium 3- (4- methoxy- spiro [1,2- dioxetane- 3,2- (5’- chloro)-tricyclo [3.3.1.1 3,7] decan]- 4- yl) phenyl phosphate (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000).
Sự truyền ánh sáng trong phản ứng này qua hai giai đoạn.
Giai đoạn 1: phản ứng “phản phosphoryl hóa” của enzyme. Anion tạo ra ngay sau đó những thể phân hủy, không phát sáng. Trong điều kiện có quá nhiều cơ chất, cường độ sáng sẽ phụ thuộc vào hàm lượng alkaline phosphatase. Phản ứng chemiluminescent sẽ có quang phổ rộng nhờ sự tái tạo nhanh của enzyme.
Giai đoạn 2: những thành phần khác trong phản ứng sẽ kích thích cường độ tín hiệu, đặc biệt là sự có mặt của đại phân tử bovine serum albumin (BSA), hoặc sự hình thành “micelles” ngậm nước như cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB), nó làm kích thích cường độ tín hiệu, và chuyển dịch độ dài sóng ánh sáng được truyền đi. Độ dài sóng tối đa là 470 nm. Sự hiện diện của micelle hoặc một màng nylon làm cho độ dài sóng tối đa khoảng 460 nm.
Các thể enhancer khác có trong phản ứng cũng có thể làm thay đổi độ dài sóng của ánh sáng truyền đi. Sự phân rã của phân tử tương đối chậm, cho nên tín hiệu ánh sáng này kéo dài được nhiều giờ hoặc cả ngày. Điều này cho phép chúng ta có đủ thời gian để chụp hình.
Hình 2.13 Cấu trúc của photobiotin acetate
Dưới điều kiện ánh sáng, nhóm hoạt tính với ánh sáng sẽ tác động trên nucleic acid để đánh dấu chúng bằng biotin.
Hình 2.14 Sự tạo liên kết giữa acid nucleic và tác nhân đánh dấu (biotin) tại vị trí N-7 của purine