Hệ thống đánh dấu các nucleic acid không dùng phóng xạ đã được áp dụng với những probe cho kỹ thuật lai DNA. Hệ thống này có nhiều ưu điểm so với hệ thống sử dụng đồng vị phóng xạ đánh dấu nucleic acid. Phương pháp đánh dấu không dùng phóng xạ làm giảm lượng chất thải khó xử lý, an toàn, thể probe ổn định hơn so với probe được đánh dấu bằng P32. Mức độ nhạy cảm của probe có đánh dấu và không đánh dấu phóng xạ đã được nghiên cứu
* Một số chất đánh dấu không phóng xạ
Biotin: Cách này được phát hiện với cơ chất là avidin hoặc streptavidin mà nó có sự tương đồng về cấu trúc với biotin.
Enzyme: Enzyme tạo sự gắn kết với probe và phát hiện sự hiện diện của nó bằng phản ứng đổi màu. Enzyme dùng trong trường hợp này thường là một nhóm enzyme như alkaline phosphatase và horseradish peroxidase.
Chemiluminescence: Ở phương pháp này người ta dùng hóa chất để tạo sự gắn kết với probe và cách thức phát hiện dựa vào ánh sáng phát ra từ luminol.
Fluorescence: hóa chất gắn kết với probe và phát sáng dưới ánh sáng UV. Kĩ thuật này có tên gọi là fluorescent in situ hybridazation (FISH).
Kháng thể (Antibodies): một nhóm kháng nguyên nối kết với probe và chúng được phát hiện nhờ vào một loại kháng thể đặc hiệu.
Hệ thống phát hiện và đánh dấu không dùng phóng xạ bao gồm các hệ thống có thuật ngữ chuyên môn là “horseradish peroxidase”, “digoxigenin - antidigoxigenin”, và “biotin – streptavidin”. Cả ba hệ thống này, thể probe lai có thể sẽ được phát hiện
với cơ chất chromogenic. Cơ chất này sẽ tạo ra ánh sáng đối với enzyme có trong hệ thống.
Horseradish peroxydase và chemiluminescence
Trong hệ thống không dùng phóng xạ này, người ta lợi dụng phản ứng hoá học để đánh dấu DNA (Stone và Durant 1991). Horseradish peroxydase (HRP) liên kết đồng hoá trị với polyethyeneimine. Trong phản ứng đánh dấu, dây đơn DNA được trộn với HRP – polyethyleneimine cộng với 1% glutaraldehyde dưới điều kiện nhiệt độ trong phòng. Glutaraldehyde là một hoá chất có tính chất liên kết chéo với hai chức năng, mà sự liên kết chéo (crosslink) đồng hoá trị như vậy sẽ làm cho marker enzym HRP tương tác với DNA probe. Phản ứng liên kết chéo xảy ra trong vòng một giờ.
Những phản ứng tiếp sau đó của probe DNA được đánh dấu bởi HRP xảy ra trong điều kiện HRP ở dạng hoạt động. Người ta dùng urea (6M) để hạ thấp nhiệt độ Tm sao cho nhiệt độ của phản ứng lai DNA là 42oC. Cả hai cơ chất chromogenic và chemiluminogenic đối với HRP cũng được sử dụng. HRP còn làm nhiệm vụ xúc tác trong phản ứng oxid hóa luminol, một cơ chất chemiluminogenic đối với HRP. Luminol ở dạng oxid hóa rơi vào trạng thái kích hoạt làm phát sáng ở độ dài sóng 428 nm. Phản ứng chemiluminescence với luminol và các enhancer tương ứng sẽ đạt được một kết quả tối đa trong một thời gian rất ngắn, khoảng 1 – 5 phút. Việc phát sinh ra ánh sáng như vậy sẽ bị mất đi trong vòng ba giờ.
Hệ thống digoxigenin
Hệ thống digoxigenin-antidigoxigenin hoạt động trên cơ sở sử dụng digoxigenin (DIG), một cardenolide steroid được phân lập từ cây Digistalis (Martin và ctv, 1990). Một dạng đồng phân của nucleotide triphosphate được gài vào phân tử DNA nhờ phản ứng giải mã có thuật ngữ “nick translation”, hoặc nhờ đánh dấu primer ngẫu nhiên. Thể probe được đánh dấu DIG này, có thể được phát hiện nhờ một xét nghiệm tính miễn dịch có liên kết với một enzyme, sử dụng trong kháng thể đối với digoxigenin (anti - DIG). Một cơ chất có tính chất chromogenic hay chemiluminogenic đối với alkaline phosphatase có thể được sử dụng để phát hiện thể probe có đánh dấu DIG.
Hệ thống biotin – streptavidin
Sự tương tác giữa biotin và avidin được sử dụng rất phổ biến trong lĩnh vực miễn dịch học. Avidin là một glycoprotein cơ bản có độ lớn 68.000 Da, được phân lập trong tròng trắng trứng gà. Avidin kết dính với biotin rất chặt, không đồng hóa trị. Mỗi phân tử avidin gắn với bốn phân tử biotin. Phản ứng kết gắn avidin – biotin tạo ra một vật chất có khối lượng lớn, bởi vì điểm đẳng điện của avidin mạnh hơn tương tác có tính tĩnh điện, và carbohydrate của avidin có xu hướng gắn với lectin như những protein. Vấn đề đặt ra cho vật chất có khối lượng lớn này là khi sử dụng hệ thống biotin – streptavidin, nó có thể bị mất. Streptavidin là một protein bên ngoài tế bào, của vi sinh vật Streptomyces avidinii, rất giống với avidin. Streptavidin có trọng lượng phân tử là 60.000 Da, với bốn tiểu đơn vị (subunit) đồng nhất, mỗi tiểu đơn vị đều có thể gắn với một phân tử biotin. Streptavidin, giống như avidin, có tính chất kết gắn với biotin rất mạnh mẽ, nhưng không phát sinh ra vấn đề do vật chất có khối lượng lớn như avidin.
Một biotin chứa một đồng phân nucleotide, được gắn vào DNA nhờ hiện tượng giải mã kiểu “nick” (Mackey và Rashtchian, 1992).
Sau khi lai, DNA có biotin đánh dấu sẽ được phát hiện nhờ hiện tượng kết gắn chuyên tính của streptavidin. Nhờ đó nó được nối với alkaline phosphatase. Cơ chất chromogenic và chemiluminogenic đối với alkaline phosphatase được sử dụng cho kết quả này (Klevan và Gebaeyehu, 1990).
Hình 2.8 Cấu trúc của biotin và hai thể đồng phân của biotin nucleotide, biotin- 7- dATP và biotin- 14- dATP
Hình 2.9Cấu trúc của digoxigenin- 11- dUTP
Thể đồng phân của nucleotide này được gắn vào DNA nhờ giải mã kiểu “nick” hoặc bằng cách đánh dấu oligo